鮭魚降鈣素對小鼠MC3T3-E1細(xì)胞BMP-2蛋白表達的影響

宋 梅

（武警內(nèi)蒙古總隊醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

骨質(zhì)疏松癥是一種骨量減少、骨組織纖維結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加，從而易發(fā)生骨折的代謝性骨病。臨床主要表現(xiàn)骨骼疼痛和骨密度降低，骨折危險性明顯增加，嚴(yán)重影響骨質(zhì)疏松患者的生活質(zhì)量。形成骨質(zhì)疏松的原因與破骨細(xì)胞功能亢進，成骨細(xì)胞作用相對不足有關(guān)。降鈣素是一種強有力的作用破骨細(xì)胞的抑制劑，可快速、廣泛抑制骨吸收[1]，因而臨床上常被用于治療高鈣血癥、原發(fā)性甲旁亢和重度骨質(zhì)疏松癥等。近年來，降鈣素作為抗骨質(zhì)吸收藥，應(yīng)用在骨質(zhì)疏松癥的臨床治療中，取得了一定的臨床療效。短期應(yīng)用具有良好的緩解骨痛作用，并顯著降低骨轉(zhuǎn)換率。一些體外實驗和體內(nèi)實驗提示，其在抑制骨破壞的同時[2-3]，也可以促進成骨細(xì)胞的形成、骨骼發(fā)育和再生修復(fù)，從而改善骨代謝[4]。骨形成發(fā)生蛋白（BMP-2）是有效的成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子，能夠促進成骨細(xì)胞分化、誘導(dǎo)體外成骨的能力，同時可以使成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞[5-6]。因此，BMP-2在成骨細(xì)胞的增殖分化中發(fā)揮重要作用。但是，鮭魚降鈣素促進成骨細(xì)胞的形成與再生修復(fù)是否與BMP-2有關(guān)，國內(nèi)外至今尚少見研究。本研究采用分子生物學(xué)手段從蛋白水平，研究不同劑量的鮭魚降鈣素對小鼠MC3T3-E1細(xì)胞BMP-2蛋白表達水平的影響，從而為鮭魚降鈣素對骨代謝提供重要理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般材料：小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞系，是由協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所提供。鮭魚降鈣素試劑購自瑞士諾華制藥公司。兔抗鼠BMP-2多克隆抗體，北京鼎國生物技術(shù)中心。兔抗鼠GAPDH多克隆抗體，北京鼎國生物技術(shù)中心。HRP-羊抗兔IgG，博士德生物技術(shù)中心。蛋白Marker，美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞鑒定：取生長良好、80%融合的小鼠MC3T3-E1細(xì)胞爬片，通過HE染色、堿性磷酸酶（ALP）染色（Kaplow氏法），監(jiān)測成骨細(xì)胞性質(zhì)。

1.2.2 實驗分組：取生長滿培養(yǎng)瓶壁的小鼠MC3T3-E1細(xì)胞，用PBS洗滌2遍，再用0.25%胰蛋白酶消化5 min，按1×105/mL密度的細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)；保證各組瓶中的培養(yǎng)液均為2 mL，放置在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后。隨機分為對照組、低劑量組鮭魚降鈣素2.5 ng/mL、中劑量組：鮭魚降鈣素5 ng/mL、高劑量組：鮭魚降鈣素10 ng/mL，每組各設(shè)8瓶，按照不同濃度鮭魚降鈣素量，加入培養(yǎng)液中，放置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 細(xì)胞提?。豪^續(xù)培養(yǎng)24 h后，各組收集培養(yǎng)瓶細(xì)胞，PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化5 min，4 ℃ 400×g離心10 min，棄上清。每個EP管中加入100 μL細(xì)胞裂解液用于提取細(xì)胞總蛋白，在冰浴中裂解15 min，4 ℃ 20000×g離心15 min，取出上清，用于測定蛋白含量。總蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡：制備樣品并進行SDS-PAGE電泳，蛋白充分變性后，各組取30 μg樣品，恒壓80 V（電流為20～40 mA），1 h后調(diào)至150 V，電泳2.5 h至溴酚藍距離凝膠底部1 cm時，停止電泳。4 ℃條件下恒壓（100 V）電轉(zhuǎn)膜2.5 h。封閉PVDF膜，室溫振蕩1 h。分別加入TBS配制的BMP-2和GAPDH兔抗小鼠單克隆抗體（1∶100稀釋），4 ℃孵育過夜，TBS洗膜3次，在轉(zhuǎn)移脫色搖床上平緩搖動，每次10 min。將PVDF膜控干水分，放進雜交袋，分別加TBS配制的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶100稀釋），37 ℃孵育1 h，用TBS漂洗膜3次，每次10 min，平緩搖動。將NC膜平鋪在保鮮膜上，采用化學(xué)發(fā)光法顯色1 min，在暗盒中曝光1 min，顯影，定影。

1.2.5 圖像分析：以上方法得到的凝膠，用ImageJ凝膠分析軟件對已經(jīng)顯影條帶進行半定量分析，AU（Darea·Ddensity）代表條帶的面積、灰度值，BMP2/GAPDH的AU比值表示蛋白相對含量。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理：用SPSS 16.5的統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組均數(shù)比較行單因素方差分析（ANOVA），用最小顯著差異法（LSD）作兩兩比較，P＜0.05有顯著性差異。

2 結(jié) 果

蛋白質(zhì)印跡顯示，各濃度鮭魚降鈣素與對照組相比，BMP-2活性明顯高于對照組，其中低劑量組（0.5620±0.020）與對照組（0.5386±0.028），中劑量組（0.6228±0.012）與對照組（0.5386±0.028）相比蛋白含量有增高，但無統(tǒng)計學(xué)意義。高劑量（0.7813±0.010）與對照組（0.5386±0.028）相比蛋白含量明顯增高，且有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1、表1。

表1 小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞BMP-2蛋白相對含量分析表

3 討 論

在研究治療骨質(zhì)疏松的過程中，降鈣素具有明顯抑制骨吸收，顯著減少骨折發(fā)生率，增加腰椎骨密度的作用。自1985年美國食品藥物管理局批準(zhǔn)用于治療骨質(zhì)疏松以來，現(xiàn)臨床廣泛運用并取得滿意療效。一定劑量的降鈣素能改變破骨細(xì)胞形態(tài)。通過與破骨細(xì)胞表面的降鈣素受體結(jié)體后抑制破骨細(xì)胞功能。也有研究報道，降鈣素能增加成骨細(xì)胞活性，從而起到改善骨質(zhì)，糾正骨質(zhì)疏松。但何種劑量的降鈣素可以影響成骨細(xì)胞的增殖，及通過何種轉(zhuǎn)移因子影響成骨細(xì)胞的表達活性，目前不得而知。

BMP-2具有誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)體外成骨的能力。正常骨基質(zhì)中含有少量的BMP-2，主要存在于成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞膜和骨髓細(xì)胞中，并通過自分泌或旁分泌形式誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，形成新的成骨[7]。將重組rhBMP-2植入到大鼠肌肉組織中，可以促進異位骨形成。離體BMP-2可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為較成熟的成骨樣細(xì)胞，并抑制肌原細(xì)胞的分化。Fromigue等[8]研究中發(fā)現(xiàn)rhBMP-2可在mRNA水平，增強堿性磷酸酶活性、骨鈣素和細(xì)胞外間質(zhì)的鈣儲備。另有研究[9]，在人的新生成骨細(xì)胞前顱蓋骨細(xì)胞中，加入rhBMP-2（50 μg/L），培養(yǎng)3～7 d，可以影響不成熟的顱蓋骨細(xì)胞，加速細(xì)胞生長，增強堿性磷酸酶活性。2～3周時，基質(zhì)礦化明顯增加，在第3周時骨鈣素mRNA和蛋白表達增強，鈣在基質(zhì)中的含量明顯增加，提示成骨細(xì)胞完全分化。由此認(rèn)為，BMP-2含量的多少直接影響著成骨細(xì)胞的分化，決定著骨重建的結(jié)局。

本研究采用小鼠MC3T3-E1細(xì)胞，根據(jù)臨床常用鮭魚降鈣素濃度，配制低、中、高濃度組鮭魚鈣素，加藥24 h，通過Western-blot技術(shù)，觀察BMP-2的蛋白表達水平變化。研究發(fā)現(xiàn)，低中劑量組鮭魚降鈣素與對照組相比，表達呈逐漸上升趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。高劑量組與對照組相比，蛋白表達水平最高，有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）。表現(xiàn)出明顯的劑量刺激關(guān)系。本試驗說明鮭魚降鈣素可以通過刺激BMP-2蛋白表現(xiàn)，促進成骨細(xì)胞增殖，降鈣素與BMP-2通過多種作用機制相互配合，協(xié)同促進骨形成和重建，從而改善骨基質(zhì)，這為骨質(zhì)疏松的臨床治療提供了新的理論依據(jù)。