鮮食葡萄表皮生物性危害因子及鏈格孢毒素分析

張偉，劉保友，臧宏偉，鹿?jié)蓡?，張悅麗，劉傳?

（1. 山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品質(zhì)量安全風險評估實驗室（煙臺），山東煙臺 265500；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/山東省植物病毒學重點實驗室，山東濟南 250100）

葡萄是世界上栽培歷史最久、產(chǎn)量最大的果樹品種之一，富含豐富的糖、有機酸、維生素、氨基酸等營養(yǎng)成分，尤其是鮮食品種味美多汁、口感優(yōu)良，深受廣大消費者的喜愛。中國是世界葡萄生產(chǎn)大國，自2011年起鮮食葡萄產(chǎn)量已位居世界首位。根據(jù)國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)，2016年我國栽培面積達80.96萬 hm2，產(chǎn)量達1262.94萬 t[1]。我國葡萄以鮮食為主，栽培面積占總面積的80%，產(chǎn)量1080萬 t[2]?！薹濉汀t地球’是我國栽培面積最大的兩個鮮食品種，2015年的面積分別是36.5萬 hm2和14.6萬 hm2[3]，尤其‘巨峰’是中國東部環(huán)渤海灣地區(qū)和南方產(chǎn)區(qū)的主栽品種?！薹濉咸咽侵惺炱贩N，于高溫多雨季節(jié)上市，且具有多汁、果刷短、容易脫離的特點，因此存在不耐貯運、易受機械損傷和雜菌污染等問題。大量研究表明，導致葡萄腐爛變質(zhì)的病原菌大多數(shù)為真菌，具有病程短、低溫貯藏中仍能生長繁殖并致病的特點[4]。國內(nèi)外很多學者對葡萄及其制品中的真菌及毒素進行研究發(fā)現(xiàn)，葡萄在生產(chǎn)、貯運、加工過程中會被真菌侵染，進而產(chǎn)生對人類身體有害的毒素，其中主要有赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、展青霉素和鏈格孢毒素等。對于葡萄及制品中赭曲霉素和黃曲霉毒素研究的較多，而對于產(chǎn)生鏈格孢毒素的鏈格孢屬真菌研究較少。鏈格孢毒素是由鏈格孢屬真菌產(chǎn)生的一系列有毒代謝產(chǎn)物的總稱，主要包括鏈格孢酚（alternariol，AOH）、鏈格孢酚甲基乙醚（alternariol monomethyl ether，AME）、鏈格孢霉素（al-tenuene，ALT）、騰毒素（tentoxin，TEN）、細交鏈孢菌酮酸（tenuzonicacid，TeA）等，鏈格孢霉毒素對人體健康存在諸多不利影響，如有報道其對人和動物有致癌、致畸、致突變性、急性毒性等多種毒性[5]。本文研究發(fā)現(xiàn)，鮮食葡萄的表皮上存在著能產(chǎn)生鏈格孢毒素的鏈格孢屬真菌，對其進行產(chǎn)毒培養(yǎng)后能夠產(chǎn)生毒素?；阪湼矜叨舅氐亩拘?，食用無有效處理的健康葡萄對膳食亦存在一定的風險。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

自山東省濰坊市臨朐縣、昌邑區(qū)、寒亭區(qū)、安丘市和煙臺市福山區(qū)、龍口市、海陽市的葡萄基地，采取成熟期葡萄樣品50份，其中‘巨峰’樣品30份（濰坊市15份、煙臺市15份）、‘紅地球’20份（濰坊市15份、煙臺市5份）。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；馬鈴薯葡萄糖肉湯液體培養(yǎng)基（PDB）。

1.3 儀器與試劑

ZHJH-2112B水平流超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；RXZ型（多段編程）智能人工氣候箱，寧波江南儀器廠；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；LDZX-50FBS上海申安醫(yī)療器械廠；KS260搖床，德國IKA公司；CX21FS1光學顯微鏡，日本Olympus公司；LCMS-8040超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，島津中國有限公司。

AOH、AME和TeA標準品（純度＞98%，新加坡Pribolab公司）；ALT（純度＞98%，加拿大TRC 公司）；乙腈（色譜純，上海阿拉丁生化生化科技股份有限公司）；NaCl（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；無水MgSO4（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲酸（色譜純，上海阿拉丁生化生化科技股份有限公司）；瓊脂（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；葡萄糖（分析純，天津市北辰方正試劑廠）。

1.4 試驗方法

1.4.1 生物性危害因子分離和鑒定

葡萄成熟期，隨機選取10穗健康果穗，在每穗上取2～3粒健康的帶梗果粒。低溫條件下于無菌袋中帶回實驗室，4 ℃冰箱保存，盡快分離。于超凈工作臺用滅菌的手術刀、鑷子隨機挑取約5 mm2果皮組織，接種到準備好的PDA平板上，每皿3塊，1粒葡萄對應1皿。將樣品倒置于培養(yǎng)箱25 ℃黑暗培養(yǎng)，待葡萄表皮周圍萌出菌落，檢查帶菌組織塊。帶菌率/%=帶菌組織皿數(shù)/總皿數(shù)×100。

將得到純化的生物性危害因子接種到PDA固體培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫倒置培養(yǎng)5 d，在顯微鏡下觀察其菌落、菌絲、分生孢子梗和孢子的形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊》[6]初步鑒定到屬。

將得到的鏈格孢屬真菌送至山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心進行DNA提取、PCR擴增；OPA2-1核苷酸序列富于變化，可作為小孢子鏈格孢系統(tǒng)發(fā)育研究的一種有用的手段[7]；OPA2-1L，5'-TGCCGAGCTGTCAGATAATTG-3'/OPA2-1R，5'-GCCGAGCTGGTGGAGAGAGT-3'；測序后結(jié)果通過GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫進行比對，并利用軟件MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行同源性分析。

1.4.2 鏈格孢霉毒素的檢測

將分離得到的A. alternata采用PDB培養(yǎng)液培養(yǎng)：每三角瓶50 mL培養(yǎng)液，高溫滅菌后，于超凈工作臺中接種106孢子懸浮液，25～28 ℃靜止或震蕩培養(yǎng)14 d后，過濾菌絲干燥，并取5 mL上清液，20 mL 0.1%甲酸乙腈溶液震蕩提取30 min，10000 r/min離心10 min，取1 mL上清液氮吹至干，30%乙腈水溶液復溶至1 mL，過0.22 μm濾膜上機測定；同時對這兩個品種的健康葡萄勻漿進行檢測。參照中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準《出口水果蔬菜中鏈格孢菌毒素的測定 液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 4259—2015）測定AOH、AME、ALT和TeA 4種毒素。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮食葡萄表皮生物性危害因子鑒定

供試菌株于25 ℃恒溫倒置培養(yǎng)5 d后，參照《真菌鑒定手冊》形態(tài)學特征初步鑒定到屬。鏈格孢屬（Alternaria）：菌落平展、淺綠色或墨綠色；分生孢子梗直立、分枝屈膝狀；分生孢子（深）褐色、鏈生，孢子形狀變化較大，有橫膈膜1～6個、縱隔膜0～5個，有喙。曲霉屬（Aspergillus）：菌落黑色或深橄欖綠色，絨毛狀，有放射性溝紋，反面黃至黃褐色；分生孢子梗由一根直立的菌絲形成，菌絲的末端形成球狀膨脹成近球形的頂囊；分生孢子球形、壁粗糙。青霉屬（Penicillium）：菌落多種顏色，綠色、黃綠色、灰綠色等；分生孢子梗直立，不分枝或于孢梗（近）頂端分枝，孢梗頂端或分枝頂端生瓶梗狀產(chǎn)孢細胞，內(nèi)壁芽生瓶梗式連續(xù)產(chǎn)生分生孢子，呈典型的帚狀；分生孢子球形、卵形或橢圓形，單孢。枝孢屬（Cladosporium）：菌落深橄欖棕色或（深）棕色、絨狀會粉狀、密集，生長緩慢、褶皺，反面橄欖黑色；分生孢子較小、鏈生、鏈狀分枝處有個明顯的深色柄。葡萄孢屬（Botrytinia）：菌落稀疏、橄欖色-棕色，有的有氣生菌絲；分生孢子梗粗大，頂端分支末端膨大，頂端生多個圓形分生孢子，分生孢子排列似葡萄穗狀。

由圖1可見，其中鏈格孢屬真菌帶菌率為14.00%；曲霉屬真菌帶菌率為57.00%；青霉屬真菌帶菌率為6.00%；枝孢屬真菌帶菌率為2.00%；葡萄孢屬真菌帶菌率為1.00%；其他（包括未萌發(fā)任何真菌的葡萄組織）為20.00%。葡萄表皮真菌中除了研究較多的曲霉屬真菌外，鏈格孢屬為第二大危害真菌。

圖1 鮮食葡萄表皮真菌種類帶菌率比較Figure 1 Comparison of rate of fungi in grape epidermis

2.2 鮮食葡萄表皮鏈格孢屬真菌帶菌情況比較

由表1看出，濰坊市15份樣品和煙臺市15份樣品的‘巨峰’葡萄表皮的鏈格孢屬真菌平均帶菌率為20.00%和13.33%，‘紅地球’葡萄的平均帶菌率分別為6.67%、20%。

表1 鮮食葡萄果皮帶菌率比較Table 1 Comparison of rate of Alternaria spp. in grape epidermis

2.3 鏈格孢屬真菌菌株鑒定

將分離純化的鏈格孢屬真菌（Alternariaspp.）于PCA培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)4～5 d后，參照《中國真菌志-鏈格孢屬》[8]，觀察真菌在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、色澤、菌絲特征、孢子形態(tài)等形態(tài)學（圖2），鑒定其為A.alternata；其主要特性是分生孢子短鏈生，分生孢子倒棍棒型、卵形，橫膈膜1～5個，縱隔膜1～4個，支鏈一般長1～5個孢子。選取形態(tài)學鑒定為A. alternata的菌株YTFT進行OPA2-1測序，得到的序列與GenBank中已注冊的序列進行BLAST，并用軟件MEGA5.1分析得到系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果顯示與Alternaria Alternatastrain QK14091823（Gen Bank編號為KT315516.1）聚在同一分支上；結(jié)合形態(tài)學進一步鑒定為A. alternata。

圖2 Alternaria alternata 分生孢子及產(chǎn)孢表型Figure 2 Conidia and sporulation pattern of Alternaria alternata

圖3 根據(jù)OPA2-1基因序列構(gòu)建的菌株YTFT系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of strain YTFT based on OPA2-1 sequences

2.4 菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)及毒素檢測

如表2選取代表性菌株5株，采用PDB配制培養(yǎng)液毒素培養(yǎng)，毒素檢測結(jié)果顯示在葡萄成熟期所分離到的A.alternata菌株均不產(chǎn)生ALT；3株菌株能產(chǎn)生TeA，含量為4～70.2 μg/L；2株菌株能產(chǎn)生AME，含量為0.3～0.4 μg/L；只有1株菌株產(chǎn)生AOH為4.1 μg/L。普通葡萄樣品中未檢測出這4種毒素。

表2 葡萄樣品及真菌發(fā)酵液中鏈格孢毒素含量檢測Table 2 Alternaria toxins detection of grapes and fermentation broth (Unit: μg/L)

3 討論與結(jié)論

本研究對山東省煙臺市和濰坊市50份‘巨峰’‘紅地球’健康葡萄樣品進行表皮生物性危害因子分離及鑒定，結(jié)果表明葡萄成熟期表皮存在的主要生物性危害因子為曲霉屬、鏈格孢屬和青霉屬真菌，帶菌率分別為57.00%、14.00%和6.00%；曲霉屬及其產(chǎn)生的霉素的特性[9-12]、篩選[13-16]及在葡萄制品中[17-19]已引起足夠的重視和研究；而對于鏈格孢屬真菌，尤其是在健康葡萄表皮上的研究較少。本文分離出的葡萄表皮的鏈格孢屬真菌主要為A. alternata，并對其進行產(chǎn)毒培養(yǎng)后能夠產(chǎn)生AOH、AME和TeA，其中TeA的含量達到4～70.2 μg/L。宋蕤[20]、許靈春等[21]亦從葡萄中分離到鏈格孢屬真菌；也有研究表明，鏈格孢屬真菌還能夠引發(fā)葡萄果實采后落粒[22]、貯藏期能夠引起果粒腐爛[23-25]，當然也存在著適合發(fā)酵的乳酸菌[26]等有益菌。林玲等[27]隨機抽取某農(nóng)貿(mào)市場、批發(fā)市場的50份葡萄樣品進行檢測其中3份檢出AME，測定值為0.25～8.53μg/kg；4份檢出AOH，測定值為1.7～15.9 μg/kg。Scott等[28]對加拿大的24份葡萄酒進行了測定，其中紅葡萄酒中AOH含量達0.03～5.02 μg/L、AME含量0.01～0.23 μg/L；還有研究報道德國某葡萄酒AOH、AME最高含量達7.60 μg/L和0.30 μg/L[29-30]。AOH和AME屬于二苯-α-吡喃酮類化合物，其毒性相對較小，但具有誘變性和致癌性，有研究表明我國某地區(qū)食管癌高發(fā)與其有密切關系[31]；TeA屬于四價酸類化合物，能導致動物急性中毒死亡，具有催吐及心血管毒性兩種基本毒性，造成出血性胃腸病和循環(huán)系統(tǒng)損傷，從而致動物死亡[32]。歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）對AOH和AME風險評估的結(jié)論為：隨膳食攝入的AOH和AME對公眾健康存在威脅[33]。盡管EFSA針對隨膳食攝入的TeA對歐洲居民健康的風險評估結(jié)論為不存在潛在威脅；但我國國家風險評估中心的結(jié)論為隨膳食攝入的TeA對2～6歲兒童存在健康威脅[34]。且有研究顯示，TeA與AOH、AME具有協(xié)同作用[35]。2016年EFSA發(fā)布不同人群中鏈格孢毒素的膳食暴露風險評估報告中指出，學步兒童對AOH、AME、TeA和Ten四種鏈格孢霉毒素的膳食暴露量最大[36]。

由于鏈格孢屬真菌能夠在低溫下繁殖生長，且葡萄多汁高糖，稍有碰傷或裂果便會給真菌提供豐富的營養(yǎng)加速其生長繁殖和擴散，所以隨著運輸、貯藏時間的增長真菌量會增加，產(chǎn)毒幾率和產(chǎn)毒量也很有可能隨之增加，膳食風險亦會隨之增高。所以在葡萄鮮食及加工前應該對其進行有效的清洗以祛除其上的生物性危害因子及其殘余物等潛在膳食風險因子。除了鮮食葡萄，釀酒品種在加工成葡萄酒的過程中是否會有潛在的鏈格孢屬真菌存在，以及針對能產(chǎn)毒的真菌進行采前采后的防治以減少帶菌率，仍需要進一步研究。本文通過研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的‘巨峰’和‘紅地球’葡萄的生物性危害因子的帶菌率有所差異，這可能是他們所處的地理位置和氣候變化有所差異，更有可能是在病害防治和田間管理上的差異引起的。同時還應研究在防治過程中引入的農(nóng)藥殘留等二次污染及混合污染問題。

目前，國內(nèi)外還沒有針對鏈格孢毒素的限量標準，但EFSA已經(jīng)對食品中鏈格孢毒素對人類健康的影響進行了相關風險評估工作，說明人們已經(jīng)十分重視鏈格孢毒素可能引起的食品安全隱患。所以鏈格孢屬真菌及鏈格孢毒素在葡萄防治及其加工過程中應成為繼曲霉屬真菌及其毒素之后又一關注重點。