癸氧喹酯干混懸劑含量測定的改進

◆作者：陳創(chuàng)華 曾海波 潘綺雯＊ 劉燕

◆單位：廣東省農產(chǎn)品質量安全中心

癸氧喹酯是一種非常有效的喹諾酮類畜禽用抗球蟲藥。在球蟲的無性繁殖階段進入子孢子細胞后，通過干擾DNA合成而阻止其發(fā)育，從而避免家禽腸道受到損害。本品吸收快，在一小時內即可達到抗球蟲的有效濃度，3天后濃度達到高峰水平，抗球蟲指數(shù)大于180，屬于高效藥物。主要用于預防雞的變位、柔嫩、巨型、堆型、毒害和布氏等引起的球蟲病。癸氧喹酯干混懸劑+原屬進口藥品，在英國有癸氧喹酯預混劑（C24H35NO5,6-癸氧基-7-乙氧基-4-羥基喹啉-3-羧 酸 乙 酯 ，6-decy-cloxy-7-ethoxy-4-hgdroxyqaindine-3-carboxylate)藥品。目前癸氧喹酯溶液含量測定方法的依據(jù)為農業(yè)部批準的第2035號（3%）和2311號（6%）兩個公告中，兩個質量標準均各有差異，難以形成統(tǒng)一、穩(wěn)定、簡便、快捷的測試方式?，F(xiàn)將兩個公告的標準合并，本次參考《中國獸藥典》癸氧喹酯預混劑中含量測定方法測定癸氧喹酯干混懸劑的含量，為該制劑的質量控制提供可靠的依據(jù)。

1 材料與儀器

高效液相色譜儀Agilent 1100；甲醇（AR）、水（超純水）、冰醋酸（AR）；規(guī)格為6%的癸氧喹酯干混懸劑樣品由成都乾坤動物藥業(yè)股份有限公司、廣州華農大實驗獸藥有限公司、廣東大華農動物保健品股份有限公司動物保健品廠提供，規(guī)格為3%的癸氧喹酯干混懸劑樣品由瑞普（天津）生物藥業(yè)有限公司提供，輔料由廣東大華農動物保健品股份有限公司動物保健品廠提供；癸氧喹酯對準品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)，批號為K0651211，含量為99.7%。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件 流動相為甲醇-水-冰醋酸（85∶15∶1）

色譜柱，WatersXSelect○RC SHTM-C184.6×150mm，5μm；檢測波長，265nm；進樣量，10μL；流速，每分鐘 1.0mL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

取癸氧喹酯對照品適量，精密稱定，置100mL量瓶中，加氯化鈣甲醇溶液（取氯化鈣1g，加甲醇100mL，超聲使溶解）適量，超聲15分鐘，放冷；用氯化鈣甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻；濾過，精密量取續(xù)濾液5mL，置50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 供試品溶液的制備

取癸氧喹酯干混懸劑適量（約相當于癸氧喹酯50mg），精密量取，置100mL量瓶中，加入氯化鈣甲醇溶液適量，超聲15分鐘，放冷，用氯化鈣甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻；濾過，精密量取續(xù)濾液5mL，置50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取 50μg/mL的對照品溶液，按2.1項下的色譜條件進樣。理論板數(shù)按癸氧喹酯峰計算為4904，分離度為 2.4（見下圖 1）。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗圖

2.4 線性關系

取每1mL中含癸氧喹酯2、10、50、100、250μg 的對照品溶液，按2.1項下的色譜條件進樣，記錄色譜圖，以對照品溶液濃度的對數(shù)值與相應的峰面積對數(shù)值計算線性回歸方程。結果表明，在2～250μg/mL范圍內，峰面積的常用對數(shù)與進樣量濃度的常用對數(shù)呈良好的線性關系，標準曲線如下圖，回歸方程Y=63.821X+6.5379 R2=1(n=5)（見下圖2）。

圖2 癸氧喹酯標準曲線

2.5 檢測限及定量限

按信噪比S/N=3時，癸氧喹酯的檢測限為0.5μg/mL；按信噪比S/N=10時，癸氧喹酯的定量限為2.0μg/mL。

2.6 精密度試驗

取廣東大華農動物保健品股份有限公司動物保健品廠樣品6份，每份約0.4g，精密稱定后，分別置100mL量瓶中，加入氯化鈣甲醇溶液適量，超聲15分鐘，放冷，用氯化鈣甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻；濾過，精密量取續(xù)濾液5mL，置50mL量瓶中，再分別加入對照品(0.2536mg/mL)各5mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積計算，得日內 RSD (n=6)為0.13%。結果表明本法的精密度良好（見下表1）。

2.7 回收率試驗

取已知含量的癸氧喹酯原料 40、50、60mg，按含量規(guī)格的80%、100%、120%，模擬制成含癸氧喹酯原料約 4.8%、6%、7.2%濃度的樣品各3批，共9批樣品，按2.1項下的色譜條件進樣，測定峰面積。結果表明回收率在99.24%～99.51%，批間RSD在 0.05%～0.28%之間，n=3（見下表 2）。

2.8 耐用性

取癸氧喹酯對照品溶液，在不同柱溫、流速、不同的流動相比例，不同色譜柱及不同的高效液相色譜儀進行測定。

2.8.1 不同柱溫

采用安捷倫色譜儀1200，以WatersXSelect○RCSHTM-C18（4.6×150mm，5μm）為色譜柱，流速為1.0mL/min，設定不同柱溫對色譜峰的影響。結果顯示，不同柱溫對主峰影響不大（見下表 3）。

2.8.2不同流速

采用安捷倫色譜儀1200，以WatersXSelect○RCSHTM-C18（4.6×150mm，5μm）為色譜柱，柱溫為25℃,設定不同流速對色譜峰的影響。結果顯示，流速大于1.0mL/min的主峰出峰時間明顯比流速0.8mL/min縮短，但柱效都能滿足檢測需求（見下表4）。

表1 精密度試驗檢測結果表

2.8.3 不同流動相比例

采用安捷倫色譜儀1200，以Waters XSelect ○RCSHTM-C18（4.6×150mm，5μm）為色譜柱，柱溫為25℃及流速為1.0mL/min,設定不同流動相比例對色譜峰的影響。結果顯示，隨著甲醇的比例增加，主峰的出峰時間明顯縮短，理論塔板數(shù)明顯下降（見下表 5）。

表2 癸氧喹酯回收率試驗檢測結果表

2.8.4 不同機型及色譜柱

設柱溫為25℃及流速為1.0mL/min,采用不同機型及色譜柱對色譜峰的影響。結果顯示，不同的色譜柱及機型均能滿足檢測需求（見下表6）。

2.9 專屬性

取溶劑、廠家提供配方輔料作為基質各適量，精密量取氯化鈣甲醇溶液5mL，置50mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為溶劑；取a-吡咯烷酮、二甲基亞砜，聚乙二醇400、氯化鎂、無水乙醇、吐溫-80按廣東燕唐藥業(yè)公司的配方配制成100mL，精密量取2mL，置100mL量瓶中，用氯化鈣甲醇溶液稀釋至刻度，精密量取5mL，置50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為輔料；按含量的方法測定，在癸氧喹酯相應的保留時間附近均無吸收，結果表明，溶劑和輔料對主成分均無干擾（見下圖3-5）。

2.10 穩(wěn)定性試驗

取對照品溶液，按2.1項下的色譜條件進樣，測定峰面積，分別在 0、2、4、8、24、48 小時進樣，考察其穩(wěn)定性。結果顯示，在48小時內主峰面積RSD仍小于2.0%，該溶液在室溫放置48小時內穩(wěn)定（見下表7）。

圖3 溶劑峰圖

圖4 輔料峰圖

圖5 癸氧喹酯對照品圖

表3 不同柱溫試驗檢測結果表

表4 不同流速試驗檢測結果表

2.11 樣品含量測定

《中華人民共和國獸藥典（2015年版）》一部癸氧喹酯預混劑（6%）質量標準和農業(yè)部公告第2035號（3%）質量標準的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗一致，只是樣品稀釋后的進樣濃度有差別。按照《中華人民共和國獸藥典（2015年版）》一部癸氧喹酯預混劑（6%）質量標準檢查樣品，和按照農業(yè)部公告第2311號癸氧喹酯干混懸劑(6%)的質量標準檢查樣品（見下表8）。

3 小結

3.1 癸氧喹酯干混懸劑標準分別收載于農業(yè)部公告2035號（3%）、2311號(6%)兩個公告中，其中，農業(yè)部公告第2035號（3%）與中華人民共和國獸藥典（2015年版）》一部癸氧喹酯預混劑（6%）的質量標準中含量測定的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗一致，測定法基本相同，只是進樣濃度不同。而農業(yè)部公告2311號（6%）的含量測定方法先加三氯甲烷10mL超聲處理15分鐘后，用氯化鈣乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2mL，置50mL量瓶中，加0.1mol/L的鹽酸溶液4mL，用無水乙醇稀釋至刻度。此質量標準使用了三氯甲烷有毒有害試劑，毒性大；且操作步驟繁瑣復雜。本研究與癸氧喹酯預混劑標準及農業(yè)部公告第2035號（3%）的含量測定方法一致，能用于癸氧喹酯干混懸劑及預混劑的含量測定，配制簡單方便，并且檢測靈敏度高。

3.2 通過本法改良測定癸氧喹酯干混懸劑的含量，靈敏度、穩(wěn)定性高，且干擾少，回收率高，結果準確，方法可靠，可為其質量控制提供依據(jù)。

表5 不同流動相比例試驗檢測結果表

表6 不同機型及色譜柱試驗檢測結果表

表7 穩(wěn)定性試驗檢測結果表

表8 含量測定各方法試驗檢測結果表