新鄉(xiāng)市大氣細(xì)顆粒物中細(xì)菌種群多樣性及分布特征

黃永超,李慧君,安 珍,徐光翠,范 威,單怡凡,姜 靜,張豐泉,李海斌,吳 輝,吳衛(wèi)東

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南省國際聯(lián)合實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

細(xì)顆粒物(particulate matter,PM2.5)極易被人體吸入并進(jìn)入全身血液循環(huán)，對人體健康造成較大危害[1-2]。已有較多研究關(guān)注PM2.5化學(xué)組分對健康的影響[3-4]。細(xì)菌在近地面空氣中普遍存在[5]，且PM2.5中的微生物具有引發(fā)組織炎癥并傳播人類、植物和家畜病原菌等危害[6]，也是反映環(huán)境空氣質(zhì)量的重要指標(biāo)。王步英等[7]分析了北京市冬季重度霾污染期間PM2.5和PM10中細(xì)菌群落特征，結(jié)果顯示，細(xì)菌種屬多樣性較高且檢測到致病菌屬的存在。大氣中細(xì)菌菌屬對營養(yǎng)及生長因子的需求比較多樣，這就導(dǎo)致了培養(yǎng)基選擇上的困難[8]，基于培養(yǎng)方法獲得的微生物信息可能會遺漏一些重要的致病菌或過敏源[9]。高通量測序技術(shù)相比傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法有著巨大的優(yōu)勢，利用高通量測序分析技術(shù)對細(xì)菌基因組中高度保守又特異性變化的16S區(qū)進(jìn)行測序分析，能檢測到大量不可培養(yǎng)的菌種，尤其是低豐度菌種，高通量測序技術(shù)已成為微生物生態(tài)學(xué)研究的一個有效的技術(shù)工具[10]。本研究以PM2.5中細(xì)菌種群為研究對象,采集新鄉(xiāng)市4個季節(jié)大氣PM2.5樣品,利用高通量測序術(shù)對PM2.5中的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測分析,討論4個季節(jié)大氣PM2.5中細(xì)菌種群分布特征和季節(jié)變化差異,旨在了解該地區(qū)大氣環(huán)境的質(zhì)量狀況,為從微生物角度闡明PM2.5對人體健康的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器TE-6070大流量顆粒物采樣器(美國Tisch公司),高純玻璃纖維濾膜(北京賽福萊博科技有限公司),二氧化硫分析儀、43i氮氧化物分析儀、48i一氧化碳分析儀、49i臭氧分析儀、1405-BEF PM10顆粒物監(jiān)測儀、1405F-BVF PM2.5顆粒物監(jiān)測儀、146i-DT3BEAA多元動態(tài)校準(zhǔn)儀、111-B2R零氣發(fā)生器、WS500-umb氣象五參數(shù)(丹麥HermoScientific公司)，810H數(shù)據(jù)采集儀(深圳研祥智能科技),YQTS-711減壓閥(上海減壓閥廠)。

1.2 PM2.5樣品采集采樣地點在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院院系樓樓頂(采樣口距離地面約22 m)。采樣時間選擇春、夏、秋、冬4個季節(jié)任意時間,每個季節(jié)采樣3 d,春季、夏季、秋季、冬季采樣時間分別為2017年4月、2017年9月、2017年11月、2018年1月。每天采樣24 h(當(dāng)日10:00至次日10:00)。每天采樣結(jié)束后的濾膜置于-20 ℃下保存，每個季節(jié)采樣結(jié)束后統(tǒng)一提取PM2.5樣品細(xì)菌基因組DNA。

1.3 4個季節(jié)空氣質(zhì)量和氣象指標(biāo)測定分別于取樣結(jié)束后記錄由1.1所列儀器自動測定的空氣質(zhì)量指標(biāo)(PM2.5、PM10、SO2、CO、NO2、O3)和氣象指標(biāo)溫度(temperature,T)和相對濕度(relative humidity,RH)，取24 h平均值。

1.4 PM2.5樣品細(xì)菌基因組DNA提取和高通量測序采用十六烷基三甲基溴化銨法(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)對PM2.5中細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行提取，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度。利用16S V4區(qū)特異引物515F(5′-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R (5′-GCCAATGGACTACHVGGGTWTCTAAT-5′)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增,反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。使用TruSeqTMDNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行文庫構(gòu)建，經(jīng)過Qubit和實時定量PCR(real-time quantitative PCR，Q-PCR)定量，文庫合格后使用Illumina HiSeq 2500 PE250進(jìn)行高通量測序，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 4個季節(jié)空氣質(zhì)量和氣象資料結(jié)果見表1。4個季節(jié)的PM2.5濃度，冬季最高，其次為春季、秋季和夏季;PM2.5污染在冬季和春季最為嚴(yán)重。夏季O3濃度最高，其余依次為春季、冬季和秋季;O3污染在夏季最為嚴(yán)重。春季、夏季和秋季的相對濕度差別不大，冬季相對濕度最低。

表1 4個季節(jié)空氣質(zhì)量和氣象資料

指標(biāo)春季夏季秋季冬季T/℃17.5±0.528.5±3.510.2±4.6-0.1±3.8RH/%58.0±9.052.3±17.157.0±9.044.2±14.4PM2.5/(μg·m-3)83.7±21.550.0±15.980.3±46.786.7±84.1PM10/(μg·m-3)156.0±25.689.0±26.2155.3±67.4128.0±106.2SO2/(μg·m-3)61.7±7.854.3±11.074.7±18.560.0±35.9CO/(μg·m-3)1.9±0.21.0±0.51.3±0.31.6±1.1NO2/(μg·m-3)32.7±4.921.3±11.229.3±6.728.3±24.1O3/(μg·m-3)65.7±8.5176.0±25.723.0±14.740.0±15.7

2.2 4個季節(jié)PM2.5樣品稀釋曲線結(jié)果見圖1。4個季節(jié)PM2.5樣品的稀釋曲線均逐漸趨向平緩，說明測序量能夠真實反映4個季節(jié)PM2.5樣品中的細(xì)菌群落組成，4個季節(jié)PM2.5中細(xì)菌豐度依次為春季>冬季>夏季>秋季。

圖1 4個季節(jié)PM2.5樣品稀釋曲線

Fig.1 Rarefaction curves of PM2.5samples in four seasons

2.3 4個季節(jié)PM2.5中細(xì)菌群落組成4個季節(jié)大氣PM2.5中共檢測到51個細(xì)菌門，相對豐度居前10位的分別為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、藍(lán)藻門、酸桿菌門、疣微菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門及浮霉菌門(表2)，其中，前4個細(xì)菌門相對豐度均在5.24%以上。

在菌屬水平上,共檢測到941個菌屬,相對豐度居前10位的菌屬分別為未鑒定葉綠體、水棲菌屬、假單胞菌屬、副擬桿菌屬、未鑒定線粒體、大腸埃希菌·志賀菌屬、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、副球菌屬、阿克曼菌屬(表3)。春、夏、秋、冬季節(jié)相對豐度較高的菌屬分別為乳桿菌屬、乳桿菌屬、未鑒定線粒體、未鑒定葉綠體。菌屬水平未知菌屬所占比例較高，春、夏、秋、冬4個季節(jié)分別為28.90%、42.78%、26.97%、29.49%。

表2 4個季節(jié)PM2.5樣品中前10位細(xì)菌門類相對豐度

Tab.2 Relative abundance of the top 10 bacterial phyla in PM2.5samples in four seasons

細(xì)菌門春季夏季秋季冬季變形菌門37.35%34.23%41.81%28.65%放線菌門24.26%16.91%13.88%9.86%厚壁菌門23.90%17.76%23.79%26.63%擬桿菌門5.24%7.49%12.01%15.84%藍(lán)藻門3.44%0.48%2.96%9.49%酸桿菌門1.71%6.90%0.66%1.66%疣微菌門0.47%3.86%0.43%2.46%芽單胞菌門0.82%2.46%0.24%0.85%綠彎菌門0.89%2.29%0.35%0.94%浮霉菌門0.39%1.25%0.22%1.08%

表3 4個季節(jié)PM2.5樣品中前10位細(xì)菌屬相對豐度

Tab.3 Relative abundance of the top 10 bacterial genera in PM2.5samples in four seasons

細(xì)菌屬春季夏季秋季冬季未鑒定葉綠體3.38%0.33%2.90%9.27%水棲菌屬0.02%0.46%4.13%0.02%假單胞菌屬0.49%1.10%2.22%5.30%副擬桿菌屬0.03%0.10%4.00%0.20%未鑒定線粒體1.18%0.22%4.57%1.53%大腸埃希菌·志賀菌屬0.16%0.97%3.41%2.01%雙歧桿菌屬0.05%0.40%3.11%0.99%乳桿菌屬7.01%3.58%2.74%1.29%副球菌屬2.89%0.16%0.73%0.44%阿克曼菌屬0.01%0.25%0.29%2.22%其他84.80%92.43%71.88%76.73%

2.4 4個季節(jié)PM2.5樣品Alpha多樣性分析結(jié)果見表4。春季和冬季PM2.5樣品細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)高于夏季和秋季，4個季節(jié)PM2.5樣品中細(xì)菌群落豐度依次為春季>冬季>夏季>秋季,4個季節(jié)PM2.5樣品中細(xì)胞群落多樣性依次為夏季>春季>冬季>秋季。

表4 4個季節(jié)PM2.5樣品細(xì)菌群落的Alpha多樣性指數(shù)

Tab.4 Alpha diversity index of PM2.5bacterial community in four seasons

季節(jié)Chao1指數(shù)ACE指數(shù)Shannon指數(shù)Simpson指數(shù)春季2256.7462310.1218.6380.989夏季1624.6571618.5699.1910.996秋季1320.0451330.1727.0670.939冬季2090.0292080.8317.9140.967

2.5 4個季節(jié)PM2.5中細(xì)菌群落Beta多樣性指數(shù)比較結(jié)果見圖2。春季、夏季、秋季PM2.5中細(xì)菌群落Beta多樣性指數(shù)兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，春季和冬季PM2.5中細(xì)菌群落Beta多樣性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 4個季節(jié)PM2.5樣品Beta多樣性組間差異箱形圖

Fig.2 Box diagram of differences among groups in Beta diversity of PM2.5samples in four seasons

3 討論

2015年全球疾病負(fù)擔(dān)報告顯示，顆粒物污染成為排名第7位的危險因素，在中國成為排名第6的危險因素，我國每10萬死亡人群中有163.1人死亡與空氣污染有關(guān)[11]。李文靜等[12]探討了2013～2015年北京市大氣PM2.5對醫(yī)院兒科門診量的影響，單污染物模型分析顯示，PM2.5對兒科總門診量、兒科呼吸系統(tǒng)疾病門診量和兒科其他疾病門診量的影響均有統(tǒng)計學(xué)意義，且以當(dāng)天的效應(yīng)最強，PM2.5濃度每升高 10 μg·m-3，上述門診量分別增加0.525%、0.589%、0.393%。多污染物模型分析結(jié)果顯示，引入其他污染物后，PM2.5對兒科總門診量和呼吸系統(tǒng)疾病門診量的影響仍有統(tǒng)計學(xué)意義，PM2.5濃度每升高 10 μg·m-3，上述門診量分別增加0.570%、0.697%。PM2.5中微生物濃度隨PM2.5濃度增加而相應(yīng)升高，微生物和過敏原介導(dǎo)的呼吸道疾病也相應(yīng)增加[6]。春季和冬季是呼吸道疾病的高發(fā)季節(jié)，且PM2.5的濃度也較高，根據(jù)本研究結(jié)果，春季和冬季樣品細(xì)菌豐度高于夏季和秋季，與文獻(xiàn)[12]報道相一致。

王步英等[7]檢測了2013年北京市冬季連續(xù)7 d PM2.5樣品中細(xì)菌種群，在門的水平上，放線菌門所占比例最高，達(dá)62.34%，其次是厚壁菌門(14.64%)、變形菌門(11.47%)、藍(lán)藻門(5.45%)和擬桿菌門(3.46%)。在屬的水平上，主要菌屬均為節(jié)桿菌屬，其次為弗蘭克菌屬。本研究中，冬季PM2.5樣品中，在門的水平，相對豐度最高的是變形菌門(28.65%)，其次是厚壁菌門(26.63%)、擬桿菌門(15.84%)、放線菌門(9.86%)和藍(lán)藻門(9.49%)。在屬的水平，相對豐度最高的是未鑒定葉綠體，其次是假單胞菌屬。由此可見，不同地域PM2.5中細(xì)菌種群差異較大。

本研究中，采樣點是在校園內(nèi)，每個季節(jié)僅采集3個樣品，且環(huán)境因子對人體健康的影響有低劑量、長時間、多途徑以及累積聯(lián)合作用等特點，不能全面代表新鄉(xiāng)市整體情況，需要增加采樣時點，聯(lián)合PM2.5中其他組分，結(jié)合門診情況，深入探討PM2.5中細(xì)菌對人體健康的影響。