超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定武夷巖茶中咖啡堿、茶氨酸和兒茶素

段聯(lián)勃，李娟，徐杰，曹士先

武夷星茶業(yè)有限公司 福建省企業(yè)技術(shù)中心，354300

“武夷巖茶韻，馥郁花果香?！蔽湟膸r茶以“巖骨花香”被廣大愛茶人士所青睞，是我國的傳統(tǒng)名茶，屬于半發(fā)酵茶，產(chǎn)于福建閩北的武夷山一帶，因茶樹生長在巖縫之中，而得名“巖茶”。武夷巖茶生長環(huán)境冬暖夏涼、雨量充沛，尤以武夷山本地的酸性巖石風(fēng)化后而孕育出巖茶的獨(dú)特韻味[1]。除此之外，特有的烘焙技術(shù)也是形成武夷巖茶特有香氣和獨(dú)特口感的關(guān)鍵因素。

茶葉內(nèi)含物質(zhì)豐富，尤以茶多酚（18%～36%）的含量最高，而茶多酚的主要成分是兒茶素，占總量的70%以上，是影響茶葉苦澀味的主要成分之一。茶葉的鮮味主要取決于茶葉中的游離氨基酸，茶葉中游離氨基酸總量為1%～2%，其中L-茶氨酸占游離氨基酸總量的50%以上。此外，茶氨酸在決定茶湯口感上至關(guān)重要，其含量越高，茶葉的澀度越弱[2]。在綠茶中，經(jīng)常以茶多酚與氨基酸含量之比即酚氨比作為評價綠茶滋味品質(zhì)的重要量化指標(biāo)[3]。本文擬以茶多酚和氨基酸中占比最大的兒茶素及L-茶氨酸含量之比，來作為評價武夷巖茶的在不同焙火程度下滋味品質(zhì)的量化指標(biāo)。

目前對紅茶、綠茶內(nèi)含物質(zhì)的主要檢測方法有分光光度法[4]、高效液相色譜-紫外法[5-9]、近紅外光譜分析法[10]、核磁共振法[11]等，其中高效液相色譜法具有效果好、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但其弊端為在分析過程中存在操作耗時長、結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)分離度不高等問題。相比之下，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測的優(yōu)越性體現(xiàn)在分析時間短，選擇性強(qiáng)，且具有很好的抗干擾能力，靈敏度高[12]，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對樣品進(jìn)行測定，直觀體現(xiàn)在不同焙火程度下武夷巖茶內(nèi)含物的變化，以期為武夷山本地的茶葉內(nèi)含物檢測提供新的技術(shù)支持。

一、材料與方法

1.主要儀器設(shè)備

FZ102型微型植物粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；SQP型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；4500型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國AB公司；SC-2546型臺式低速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；HH8型恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；UPT-Ⅱ-20T型超純水制備儀，成都超純科技有限公司。

2.材料與試劑

甲醇：色譜純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；L-茶氨酸（L-The）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、沒食子酸（GA）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、咖啡堿（CAF）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）等8種標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.90%，上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司；試驗(yàn)用水為自制超純水。

3.色譜分析條件

色譜柱：Kinetex@2.6um Biphenyl 100A°（3.0 mm×100 mm）；A相為10 mmoL乙酸銨+0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；流動相流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40℃，等梯度洗脫A/B為20%，進(jìn)樣4 min[13]。

4.質(zhì)譜分析條件

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI+）、（ESI-），溫度450℃，電壓4.5 kV；霧化氣GS1壓力50 PSI；霧化氣GS2壓力50 PSI；定性、定量離子，DP、CE等質(zhì)譜條件如表1。其中L-The、EGC、C、EC、CAF、EGCG、ECG采用正離子掃描模式，GA采用負(fù)離子掃描模式。

5.對照品溶液的配制

內(nèi)含物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液2.0 mg/mL[14]：分別精密稱取 C、EC、EGC、ECG、EGCG、CAF、GA、L-The標(biāo)準(zhǔn)樣品各20 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中搖勻，制得2.0 mg/mL的內(nèi)含物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)母液。

內(nèi)含物質(zhì)的中間標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.05 mg/mL：取內(nèi)含物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.5 mL于10 mL的容量瓶中，并用甲醇定容至10 mL。

根據(jù)樣品中8種物質(zhì)的含量，取內(nèi)含物質(zhì)的中間標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行配制，得到不同濃度的線性標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

6.樣品的制備

武夷星茶業(yè)有限公司生產(chǎn)的不同焙火程度的茶葉樣品，分別為“清雅”大紅袍（輕火）、“醇香”大紅袍（中火）、“紅韻”大紅袍（中火）、“蘊(yùn)藏八載”大紅袍（中足火）及“八三茶人”大紅袍（足火），其中“蘊(yùn)藏八載”大紅袍為陳年大紅袍。

表1 質(zhì)譜條件參數(shù)

（1）將茶葉磨成粉末，過70目分樣篩，裝入樣品自封袋中，貼好樣品標(biāo)簽，待用。

（2）提?。悍Q取0.2 g樣品于10 mL的離心管中，加入70%甲醇水溶液[15]（事先預(yù)熱5 min）5 mL，立即移入70℃水浴鍋中，浸提10 min后冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入3 500 r/min條件下離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)于10 mL的容量瓶中，殘?jiān)貜?fù)以上操作。

（3）合并以上提取液用70%甲醇水溶液定容至10 mL，搖勻，過濾，待用。

（4）測試液：移液管移?。?）中提取液50 μL至進(jìn)樣瓶中，并用純水定容至1 mL。組內(nèi)平行試驗(yàn)3次。

二、結(jié)果與分析

1.線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

對不同焙火程度的武夷巖茶樣品中L-The、C、EC、GA、EGCG、EGC、CAF、ECG這8種內(nèi)含成分進(jìn)行分析。具體操作為將前述工作標(biāo)準(zhǔn)溶液按照線性濃度曲線進(jìn)行配制，得到線性方程，后將待測樣加入此線性方程進(jìn)行對比，根據(jù)峰面積進(jìn)行推算各成分含量。8種有效成分的線性方程及相關(guān)系數(shù)見表2。

2.8種內(nèi)含物質(zhì)的總離子色譜圖

對茶葉中8種內(nèi)含物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測試，得出每種物質(zhì)的離子保留時間，見圖1。

3.不同焙火程度武夷巖茶中L-茶氨酸、咖啡堿和兒茶素含量

分析各茶樣8種內(nèi)含物質(zhì)的含量，結(jié)果見表3、表4。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算不同焙火程度樣品中兒茶素及L-茶氨酸的比值，如圖2。

由檢測結(jié)果可知，隨著輕火到足火焙火程度的遞增，EC、ECG、EGC、EGCG、L-The等含量總體上呈現(xiàn)下降趨勢，這與張蕾等[16]人的研究一致，說明在不同焙火程度下武夷巖茶的滋味發(fā)生了明顯的變化。兒茶素與L-茶氨酸的比值能體現(xiàn)不同焙火程度的產(chǎn)品的鮮爽度，兩者的比值越高，茶樣的鮮爽度越低。中足火的“蘊(yùn)藏八載”大紅袍的兒茶素與L-氨基酸比值比足火的“八三茶人”大紅袍要高，是因?yàn)椤疤N(yùn)藏八載”大紅袍為陳茶產(chǎn)品，查閱文獻(xiàn)[17]可知是因?yàn)殛惒柙谫A藏的過程中，其內(nèi)含物成分含量均會隨著時間的延長而降低，因此，鮮爽度不高。

表2 8種內(nèi)含物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及相關(guān)系數(shù)

圖1 8種內(nèi)含物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品在正負(fù)同時掃描模式下的總離子色譜圖

三、討論

武夷巖茶滋味醇厚，本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定不同焙火程度武夷巖茶的內(nèi)含物質(zhì)，可以將武夷巖茶中的內(nèi)含物質(zhì)進(jìn)行定性定量。對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，通過兒茶素與L-茶氨酸的比值可以直觀判斷武夷巖茶的焙火程度。本試驗(yàn)所用方法，試驗(yàn)過程中對樣品的處理操作簡單，對前處理的試劑要求低，相對于超高效液相色譜[18-19]，對相近物質(zhì)的分離度高、靈敏度高，因此，本文所述的檢測方法能夠?qū)ξ湟膸r茶品質(zhì)提供準(zhǔn)確的評價，并對茶葉品質(zhì)的提升具有潛在價值。

表3 不同焙火程度武夷巖茶的L-茶氨酸、咖啡堿、沒食子酸的測量值及均值

表4 不同火工下武夷巖茶的兒茶素含量及均值 mg/g

圖2 5種武夷巖茶的兒茶素與L-氨基酸的比值