空間搭載長雙歧桿菌BBMN68耐氧株篩選及其耐酸耐膽鹽特性

隋馨瑤，孫二娜，王瑩，趙亮,3，孫健，牛天驕，張明，文鵬程

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；3.河北省畜產(chǎn)食品工程技術(shù)研究中心，河北 三河 065200；4.蒙牛高科乳制品(北京)有限責任公司，北京 101107；5.北京工商大學食品學院，北京 100048)

航天誘變技術(shù)就是利用返回式衛(wèi)星搭載，將生物材料帶入太空，在太空特殊的環(huán)境下，對種子進行多項誘變處理，改變種子的基因，從中篩選有益突變，獲得新品種[1].近幾年，我國已經(jīng)開始利用航天誘變技術(shù)對微生物進行誘變，并得到了較理想的結(jié)果.在2007年，魏麗勤等[2]通過返回式衛(wèi)星空間誘變的方法，對泰樂菌素的最終產(chǎn)量進行了空間誘變，發(fā)現(xiàn)弗氏鏈霉菌產(chǎn)泰樂菌素比出發(fā)菌株增加了74.6%[2].荊士華等[3]在2011年將生黑醋酸桿菌送入太空，利用空間搭載對該菌株進行誘變，經(jīng)過篩選得到了一株高活性的生黑醋酸桿菌G454，該菌株在縮短發(fā)酵周期的同時，提高了7.68%山梨糖產(chǎn)率[3].在2014年李雄超等[4]將干酪乳桿菌G5搭載“神舟八號”飛船進進入太空，進行航天誘變，誘變后的菌株經(jīng)過篩選，獲得了2株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌，其菌株胞外多糖的產(chǎn)量分別較對照提高1.9倍和1.7倍[4].

早在1899年，法國學者Tissier從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離得到了雙歧桿菌(Bifidobacterium)，該菌株形態(tài)不一，無芽孢，呈現(xiàn)革蘭氏陽性，是一種厭氧型桿菌[5].經(jīng)過多位學者研究發(fā)現(xiàn)，該菌株在人體消化系統(tǒng)中有益生作用，可以促進人體發(fā)育，提高人體免疫力，減緩衰老，同時在抗腫瘤方面也充當重要角色[6-11].目前，在人體健康方面，雙歧桿菌已成為重要指標之一[12].雙歧桿菌屬于專性厭氧菌，具有獨特的果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶，嚴格厭氧[13]，在加工、包裝和貯藏過程中活力降低，在應用及貯存過程中接觸氧氣會嚴重威脅其存活及益生功能的發(fā)揮.因此，如何提高雙歧桿菌的耐氧性是促進其廣泛應用的關鍵問題.

本研究選用的長雙歧桿菌BBMN68來源于健康長壽老人腸道，研究表明BBMN68具有調(diào)節(jié)免疫[14-15]、改善腸道消化功能、改善便秘、增強機體免疫及抗衰老的作用[16-20]，是優(yōu)良的益生菌.2016年10月，長雙歧桿菌BBMN68搭載“神舟十一號”飛船經(jīng)過33 d太空誘變后返回.本研究以長雙歧桿菌BBMN68為出發(fā)菌株，利用航天誘變技術(shù)對其進行誘變處理，以期獲得高產(chǎn)酸的突變株，并對篩選到的突變株進行生長情況、形態(tài)及耐受性評價，為菌株應用提供基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株及空間搭載 本試驗采用的出發(fā)菌株為長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)BBMN68，此菌株是本實驗室從廣西巴馬長壽老人的糞便中分離篩選得到的，經(jīng)研究，該菌株具有良好的益生功能.現(xiàn)菌株保存在中國農(nóng)業(yè)大學教育部功能乳品重點實驗室.本試驗將長雙歧桿菌BBMN68凍干粉置于無菌搭載小管中，搭載前4 ℃保存.“神舟十一號”返回式飛船2016年10月17日發(fā)射，2016年11月18日返回地面，飛行過程中樣品置于飛船返回艙，返回地面后取出樣品，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，酵母浸粉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸二銨2 g，無水乙酸鈉5 g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.58 g，硫酸錳(MnSO4·H2O)0.2 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH至6.5.

MRSC液體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中每升添加半胱氨酸0.5 g.

MRSC固體液體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基成分同液體培養(yǎng)基，每升添加瓊脂15 g。

MRSC耐膽鹽培養(yǎng)基：MRSC液體培養(yǎng)基中膽鹽含量根據(jù)試驗要求添加.

保護劑：12%脫脂乳中加入30%甘油.

所有培養(yǎng)基均121 ℃滅菌15min.

1.1.3 主要儀器及設備 WFZ UV-2102PC型紫外可見分光光度計：上海Unico 公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；XSZ-4G顯微鏡：COIC公司；TGL-16B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；LDZM立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DK-98-II2KW潔凈工作臺：天津泰斯特儀器公司；DELTA320 pH計：METTLER-TOELDO公司；T100 PCR儀：美國伯樂公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離與鑒定 將MRSC液體培養(yǎng)基分裝于厭氧管中，每管10 mL，向其充入氮氣，使管中形成無氧條件，經(jīng)121 ℃滅菌15 min后備用.將航天誘變后菌粉接種于所述的pH 6.5的MRSC液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)12 h 后，將菌液進行10倍梯度稀釋，稀釋液均勻涂布于固體平板，將平板倒置于裝有厭氧產(chǎn)氣袋的厭氧盒中，將其放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h，從固體平板上挑取單菌落30個接種液體試管培養(yǎng)12 h后，進行革蘭氏染色和鏡檢，觀察菌體顏色、大小、分叉形狀等是否符合雙歧桿菌屬的基本形態(tài)特征.按參考文獻[21]的方法提取菌株基因組DNA，并進行16S rDNA基因序列分析以確定菌株純度.

1.2.2 菌株保藏 經(jīng)過鑒定后，確定為長雙歧桿菌的菌株，將其接種在新鮮的pH 6.5的MRSC液體培養(yǎng)基中，將其放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h左右，將培養(yǎng)后的菌液在超凈工作臺中進行轉(zhuǎn)移，將其轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中進行離心10 min(4 200～4 500 r/min)，棄去上清液，加入保護劑2 mL，充分混勻，用移液槍吸取1 mL分裝于1.5 mL離心管中，于-20 ℃中保存[22].

1.2.3 耐氧菌株的篩選 將經(jīng)過鑒定的菌株與野生株BBMN68接種、活化2代后，按1%接種量分別接種于pH6.5的MRS和MRSC液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h后，用紫外可見分光光度計分別測定不同培養(yǎng)條件下的菌懸液的光密度值D600nm，并計算有氧條件與無氧條件下D600nm的比值.進行穩(wěn)定重復試驗，傳10代后，與野生株耐氧能力進行比較，得到耐氧能力顯著高于野生株且穩(wěn)定性較好的突變株[23].

1.2.4 生長曲線的測定 將突變株與原始菌株BBMN68接種、活化2代后，按1%接種量分別接種于pH6.5的MRSC厭氧培養(yǎng)基中，將其放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)24 h，在培養(yǎng)過程中，每隔2 h用紫外分光光度計測定菌懸液的光密度值D600nm，繪制D600nm光密度值對培養(yǎng)時間的生長曲線[24].

1.2.5 透射電鏡分析 將突變株與原始菌株BBM N68接種、活化后，分別等量接種于pH值為6.5的MRSC培養(yǎng)基中，在厭氧條件下37 ℃連續(xù)培養(yǎng)12 h后，進行下面透射電鏡樣品處理：

1)取樣：取培養(yǎng)后的樣品離心(轉(zhuǎn)速3 000～4 000 r/min)，棄去上清液，收集菌體，并用pH(7.2～7.4)的0.1 mol/L PBS清洗菌體3遍；清洗時菌體溫柔懸浮.

2)固定：將上述得到的菌體用2.5%戊二醛固定3 h，并用PBS清洗2遍，每遍10 min，再用純水清洗2遍.

3) 電鏡觀察：將固定后的菌體進行透射電鏡TecnaiG2F20S-TWIN(200KV) 觀察.

1.2.6 菌株耐酸能力的測定 參考Patel的方法[25].將活化好的菌株以2%的比例接種于pH值為6.5的MRSC培養(yǎng)基中，在厭氧條件下37 ℃連續(xù)培養(yǎng)15 h后，分別以2%的接種量接種于pH值為4.0、3.5和3.0的MRSC培養(yǎng)基中.37 ℃下分別培養(yǎng)0、2、4 h，對突變菌株與原始菌株進行平板計數(shù)，計算菌株致死率.每組試驗至少有3個重復.

1.2.7 菌株耐膽鹽能力的測定 參考Patel的試驗方法[25].將待測菌株接種、活化后，按2%接種量分別接種于pH6.5的MRSC培養(yǎng)基中，在厭氧條件下37 ℃連續(xù)培養(yǎng)15 h后，分別以2%的接種量接種于含0.1%、0.2%、0.3%膽鹽的MRSC膽鹽培養(yǎng)基中.37 ℃下分別培養(yǎng)0、1、2、3、4 h，對突變菌株與原始菌株進行平板計數(shù).

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Excel 2016和SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)，運用ANOVA進行統(tǒng)計學分析，平均值和標準差均由3個重復值所得.單因素方差檢驗采用Duncan’s新復極差法檢測，顯著水平α=0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與鑒定結(jié)果

根據(jù)1.2.1所描述的方法進行了菌株的分離與鑒定.經(jīng)電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，所挑取菌種的菌體形狀多數(shù)呈現(xiàn)棍棒狀，分叉 Y形棒狀.將這些菌株進行DNA提取，并進行16S rDNA基因的PCR擴增，將PCR產(chǎn)物純化后委托上海生工生物技術(shù)有限公司測序，得到了16個菌株，將測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上應用BLAST 軟件在基因庫中進行同源性比對.結(jié)果顯示，16株的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物的核心序列與長雙歧桿菌BBMN68的基因序列一致，因此鑒定為長雙歧桿菌.

2.2 耐氧菌株的篩選

由表1有氧無氧的光密度比值可知，16株菌株中，8株耐氧能力較野生株顯著下降，6株耐氧能力與野生株無差異，只有2株耐氧能力比野生株略高，即比值最高的2個菌株，分別為B-3-3和B-4-3.進行穩(wěn)定性重復試驗，傳10代后，與野生株耐氧能力進行比較，結(jié)果見表2.由表2可以看出，經(jīng)過10代后，有氧D600nm/厭氧D600nm比值只有B-4-3耐氧能力顯著高于野生株，說明經(jīng)過航天誘變的菌株耐氧能力比野生株有一定的提高且具有一定的遺傳穩(wěn)定性.

表1 長雙歧桿菌BBMN68在有氧與無氧條件下的生長情況

同列相同字母表示不同菌株間無顯著性差異，同列不同字母表示不同菌株間有顯著性差異(P<0.05).

The same letters in the same column indicate no significant difference,the different letters indicate significant difference(P<0.05).

表2 突變株與野生株BBMN68耐氧能力比較

每列相同字母表示不同菌株間無顯著性差異；每列不同字母表示不同菌株間有顯著性差異(P<0.05).

The same letters in the same column indicate no significant difference,the different letters indicate significant difference(P<0.05).

2.3 耐氧菌株的生長曲線

為了解突變株的生長情況，測定了在600 nm處突變株與野生株2 4h的D值，結(jié)果見圖1.0～12 hD值不斷提高，16 h時達到對數(shù)穩(wěn)定期，此后曲線趨于平緩，經(jīng)統(tǒng)計分析B-4-3突變株在厭氧條件下的生長情況基本與野生株保持一致，表明了其在耐氧性提高的同時，其原有生長特性也沒有改變.

圖1 野生株BBMN68與突變株B-4-3 24 h生長曲線Figure 1 Growth curve of wild-type strain BBMN68 and mutant strain B-4-3 for 24 h

2.4 耐氧菌株電鏡結(jié)果

野生株和突變株的形態(tài)比較見圖2.圖2-A為野生株，其形態(tài)呈彎曲棒狀，邊緣較整齊；圖2-B為突變株，其形態(tài)與野生株無差異，說明航天誘變并沒有改變菌株形態(tài).

2.5 耐氧菌株耐酸能力評價

根據(jù)1.2.6的方法對野生株和突變株的耐酸能力進行比較，結(jié)果見表3.在不同 pH值的培養(yǎng)液中，雙歧桿菌活菌數(shù)隨 pH值的降低數(shù)量減少，雙歧桿菌在低 pH值條件下生長受到抑制，其原因可能在于酸性環(huán)境使糖代謝關鍵酶(6-磷酸果糖激酶)受到了反饋抑制，使雙歧桿菌的代謝受到了抑制，減少了細胞構(gòu)建所需能量和物質(zhì)提供，從而阻遏了菌體生長以及存活[26].此外，在pH值4.0培養(yǎng)2 h與4 h，突變株較野生株的存活率顯著升高，而在pH 3.5與pH 3.0條件下，突變株與野生株各時間存活率并無明顯差異，且存活率較低，說明突變株維持了良好的耐酸能力.

圖2 長雙歧桿菌BBMN68野生株(A)與突變株(B)形態(tài)Figure 2 Bifidobacterium longum BBMN68 wild strain (A) and mutant strain (B)

表3 耐氧菌株耐酸能力評價

同列相同字母表示不同菌株間無顯著性差異；同列不同字母表示不同菌株間有顯著性差異(P<0.05).

The same letters in the same column indicate no significant difference,the different letters indicate significant difference(P<0.05).

2.6 耐氧菌株耐膽鹽能力評價

野生株和突變株的耐膽鹽能力比較結(jié)果見表4.在不同膽鹽濃度的培養(yǎng)液中，雙歧桿菌活菌數(shù)隨 膽鹽濃度值的升高數(shù)量減少，雙歧桿菌在高膽鹽濃度條件下生長受到抑制.0.1%膽鹽條件下培養(yǎng)2 h，野生株的存活率為62%左右，而突變株的存活率達到71%左右，比野生株提高了10%，當培養(yǎng)時間達到4 h后，突變株與野生株存活率基本相同，且存活率保持在50%左右；與0.1%膽鹽含量相比，在0.2%與0.3%膽鹽含量的培養(yǎng)條件下，突變株與野生株的存活率均明顯下降，說明膽鹽對于長雙歧桿菌BBMN68的生長有抑制作用.在膽鹽環(huán)境培養(yǎng)4 h過程中，突變株與野生株的存活率無顯著性差異，說明航天誘變沒有降低長雙歧桿菌對膽鹽的耐受能力.

表4 耐氧菌株耐膽鹽能力評價

同列相同字母表示不同菌株間無顯著性差異，同列不同字母表示不同菌株間有顯著性差異(P<0.05).

The same letters in the same column indicate no significant difference,the different letters indicate significant difference(P<0.05).

3 討論

航天誘變技術(shù)具有很多優(yōu)點，可以進行多方面誘變，并且誘變率較高.本次試驗采用的菌株為長雙歧桿菌BBMN68，將其進行航天誘變后，菌株的耐氧能力發(fā)生了較大的變化.結(jié)果顯示，突變株B-4-3耐氧能力顯著高于野生株，耐氧能力提高20%左右.本次試驗將篩選得到的突變菌株連續(xù)傳代10次，突變菌株B-4-3耐氧能力在傳代1～10次間無顯著性差異，具有穩(wěn)定的遺傳性.

乳酸菌在工業(yè)生產(chǎn)中以及作為益生菌在人體胃腸道系統(tǒng)中都不可避免的面臨著來自外界環(huán)境的多種環(huán)境脅迫，如在發(fā)酵生產(chǎn)過程中隨著乳酸的積累導致的酸脅迫、制劑化過程中的冷凍脅迫、在人體胃腸道系統(tǒng)中所經(jīng)歷的胃酸和膽鹽脅迫等，這些脅迫嚴重影響了乳酸菌的生長、代謝及生理功能，從而影響了益生功能的發(fā)揮.因此，如何提高乳酸菌對各種環(huán)境脅迫的抗性，成為了學術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界共同關注的焦點.本試驗對菌株的耐酸能力進行評價，突變株與野生株各時間存活率并無明顯差異，且存活率較低，說明突變株維持了良好的耐酸能力.

膽汁酸在肝臟合成，并與?；撬岷透拾彼峤Y(jié)合形成膽鹽，廣泛存在于哺乳動物和其他脊椎動物體內(nèi)[27].在人體中，膽鹽的主要生理功能是作為生物乳化劑，乳化食物中的脂肪，促進脂肪的消化吸收.磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)是微生物細胞膜的骨架，膽鹽可以破壞脂質(zhì)結(jié)構(gòu)進而造成微生物細胞泄露甚至細胞死亡[28]，因此膽鹽是人體對抗外來有害微生物的重要生理屏障.然而膽鹽的這一生理功能也為口服益生菌產(chǎn)品的有效性帶來了負面影響，耐受宿主消化道的膽鹽成為益生菌篩選的必要前提條件.在現(xiàn)有的文獻報道中，已有大量關于乳酸菌對膽鹽耐受機理的研究.其中，菌體表面疏水性[29]、菌體抗氧化能力[30]、膽鹽水解酶活性、膽鹽環(huán)境中的細胞完整性[31]是相關研究關注的主要生理指標，菌體膽鹽耐受能力的變化，引起了相關生理指標的變化.本文中耐膽鹽試驗旨在證明航天誘變沒有降低長雙岐桿菌對膽鹽的耐受能力.

本研究是利用空間搭載對長雙岐桿菌BBMN68進行誘變，改變其菌株的耐氧能力.本研究的突出點正是利用了這種新型的誘變技術(shù)，但其中也有不足之處，航天誘變并不能確保其某一特性變化的同時，保持其他性質(zhì)不變.原因在于航天誘變是利用太空特殊的環(huán)境使菌株產(chǎn)生突變，主要是通過強輻射、微重力、高真空等太空綜合環(huán)境因素誘發(fā)變異.航天誘變對含有益生菌的新型發(fā)酵乳制品的研制，似乎是一種有趣的方法.

4 結(jié)論

通過航天誘變共分離出16株突變菌株，獲得1株耐氧性能較好的菌株，在MRS不充氮氣的厭氧管中可以正常生長且具有一定的穩(wěn)定性，與野生株耐氧能力相比，一株突變株耐氧能力顯著提高.經(jīng)16S rDNA測序，鑒定該菌株仍為長雙歧桿菌BBMN68.雙歧桿菌活菌數(shù)隨 pH值的降低數(shù)量減少，在較高pH值條件下，突變株較野生株的存活率顯著升高，在較低pH值條件下，突變株與野生株各時間存活率并無明顯差異；突變桿菌活菌數(shù)隨膽鹽濃度值的升高數(shù)量減少.耐受性試驗說明突變株在增加了耐氧能力的同時，仍基本保持了菌株原有的其他方面性能.本研究結(jié)果為益生菌BBMN68的廣泛應用奠定了基礎.