H2S作為植物個體間交流的氣體信號分子

劉志強 曹純玉 李亞文 渠娟娟 賈云乾 裴雁曦

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,特色植物資源研究與利用山西省重點實驗室,太原 030006)

交流是一種重要的生存能力，人與人之間、動物與動物之間，以及細胞與細胞之間都存在著獨特的交流方式，那么植物與植物之間呢？它們是否也在“竊竊私語”？答案是肯定的。

自由跨膜是氣體信號分子的特征之一[21]。生理濃度下的外源H2S處理可以提高植物對多種脅迫的抗性；并且脅迫會引起植物內(nèi)源H2S含量的升高[22～23]，那么當植株受到環(huán)境脅迫時，細胞內(nèi)的H2S是否會釋放到空氣中，成為植株間的報警信號，在植株間起到通訊的作用？本論文對此進行了研究。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

本實驗所用植物材料包括：擬南芥(Col-0、lcd/des1突變體)、谷子(晉谷21號)、白菜(津育75號)、番茄(MicroTom)。選擇飽滿的種子，4℃春化48 h，種植在營養(yǎng)土和蛭石(2∶1)的混合基質(zhì)中，生長4周。培養(yǎng)條件為：溫度23±1℃，60%相對濕度，晝/夜周期16/8 h，光照強度為3 000 lx。

1.2 植物葉片H2S含量的測定

參考Li等的方法[24]，0.1 g葉片用2 mL提取液(50 mmol·L-1磷酸緩沖液pH6.8，0.2 mol·L-1抗壞血酸和0.1 mol·L-1EDTA)研磨；將勻漿液轉(zhuǎn)移到可密閉的小瓶中，放置含0.5 mL 1% Zn(Ac)2溶液的吸收小管，向勻漿中加入1 mL HCl(1 mol·L-1)，密封小瓶；于室溫反應(yīng)30 min，向吸收管加入DPD和FeCl3溶液，混勻避光放置15 min，測溶液667 nm的吸光值，根據(jù)標準曲線得出H2S濃度后，再根據(jù)公式計算H2S含量。

H2S含量(μmol·g-1FW)=H2S濃度×(0.5+0.2+0.2)×0.001/鮮重

(1)

1.3 空氣中H2S濃度的檢測

對照組和PEG 8000處理組植物材料分別置于玻璃缸內(nèi)(7 L)，放置含0.5 mL 1% Zn(Ac)2溶液的EP管，用于吸收缸內(nèi)空氣中的H2S氣體，12 h后取出EP管，分別加200 μL DPD(Dimethyl-p-phenylenediamine，20 mmol·L-1)和FeCl3(30 mmol·L-1)溶液，混勻避光放置15 min，測溶液667 nm的吸光值，根據(jù)標準曲線計算空氣中H2S濃度，為0 h數(shù)據(jù)。向處理組植物材料的土壤中加20 mL 40% PEG 8000，放置Zn(Ac)2溶液，12 h后檢測。之后每12 h放置新的Zn(Ac)2溶液，分別為脅迫24、36、48 h樣品。對照組不進行脅迫處理，置于玻璃缸，每12 h放置新的Zn(Ac)2溶液。

1.4 PEG 8000處理植株對鄰近植物H2S含量和基因表達的影響

谷子幼苗分為A、B兩組，分別置于7 L的玻璃缸內(nèi)。A組為對照(Control)，缸內(nèi)植株不進行脅迫處理；B組缸內(nèi)植株分為PEG 8000處理植株和非處理(un-PEG 8000)植株；處理時向處理植株的土壤加入20 mL 40% PEG 8000，處理時間為12 h。檢測Control、PEG 8000、un-PEG 8000三種條件下谷子葉片H2S含量。白菜、番茄和擬南芥Col-0幼苗分別按上述進行處理后檢測葉片H2S含量，PEG 8000的處理時間為24 h。

谷子、白菜、番茄和擬南芥Col-0幼苗分為A、B兩組，每組含四種植物。分別置于7 L的玻璃缸內(nèi)。A組缸內(nèi)植株不進行脅迫處理(Control)；B組缸內(nèi)的部分谷子幼苗進行40% PEG 8000處理12 h；檢測A組和B組缸內(nèi)非脅迫處理的(un-PEG)谷子、白菜、番茄和擬南芥Col-0幼苗葉片H2S含量。檢測A組缸內(nèi)谷子、白菜和擬南芥Col-0和B組缸內(nèi)非脅迫處理(un-PEG)的谷子、白菜和擬南芥Col-0幼苗葉片中H2S響應(yīng)基因的表達變化。

1.5 基因表達檢測

提取植株葉片總RNA，按abm公司試劑盒(Cat.No.G492)進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以各植物的Actin基因作為內(nèi)參，利用qRT-PCR檢測基因轉(zhuǎn)錄水平變化，結(jié)果以2-δδCt計算，所用引物見表1。

1.6 氣孔觀察

擬南芥野生型Col-0和突變體lcd/des1分成三組：對照組、PEG 8000處理的Col-0及處于同一玻璃缸內(nèi)的不處理Col-0和lcd/des1、PEG 8000處理的lcd/des1及處于同一玻璃缸內(nèi)的不處理Col-0和lcd/des1。PEG 8000處理12 h，顯微鏡觀察和記錄玻璃缸內(nèi)葉片氣孔孔徑。

1.7 統(tǒng)計分析

使用SPSS Statistics軟件對3次生物學(xué)重復(fù)的實驗數(shù)據(jù)進行分析，用“平均值±標準偏差”表示。

2 實驗結(jié)果

2.1 PEG 8000處理植物提高周圍環(huán)境空氣中H2S含量

可自由通過細胞膜是氣體信號分子的特征之一。生理濃度的外源H2S處理提高植物對干旱、鹽等逆境脅迫的抗性[25～26]，即外源的H2S氣體可以進入細胞發(fā)揮其生理功能。H2S氣體信號分子參與植物對多種非生物脅迫的響應(yīng)，即脅迫引起植物內(nèi)源H2S含量升高，那么細胞內(nèi)的H2S是否會向空氣中釋放？40% PEG 8000處理擬南芥，谷子，白菜和番茄植株，每12 h檢測空氣中H2S濃度，結(jié)果表明：脅迫處理谷子12、36 h，處理白菜24、36 h，處理番茄24、36、48 h，處理擬南芥Col-0野生型12、24、36 h后，都檢測到空氣中的H2S含量升高(圖1A)；而擬南芥內(nèi)源H2S產(chǎn)生酶基因突變體lcd/des1在40% PEG 8000處理后，沒有引起空氣中H2S濃度升高(圖1A)。脅迫引起空氣中H2S濃度升高，因此對鄰近的非脅迫植株的內(nèi)源H2S含量進行檢測。結(jié)果表明：受脅迫植株(圖1B，PEG)和處于同一個玻璃缸中的非脅迫植株葉片的H2S含量(Fig.1B，un-PEG)都高于對照(圖1B，CK)，即受脅迫植株釋放的H2S可引起鄰近的同物種植株內(nèi)源H2S含量升高。

表1 qRT-PCR所用的引物列表

圖1 PEG 8000處理植物對空氣中H2S濃度和鄰近非脅迫植株內(nèi)源H2S含量的影響 A.縱坐標表示空氣中H2S濃度，橫坐標表示PEG 8000處理時間；B.縱坐標表示植物葉片內(nèi)源H2S含量(CK.未處理植株；PEG. 40% PEG 8000處理12 h；un-PEG.與PEG 8000處理植株處于同一玻璃缸內(nèi)的未處理植株) *表示在P<0.05水平存在顯著性差異，Duncan test(下同)。Fig.1 Effect of PEG 8000 on the concentration of H2S in air and endogenous H2S content in nearby un-treated plantA.The ordinate indicates the H2S concentration in the air,and the abscissa indicates the PEG 8000 treatment time; B.The ordinate indicates the endogenous H2S content of the plant leaves(CK. Untreated plants; PEG. 40% PEG 8000 for 12 h; un-PEG. Untreated plants in the same glass jar as the PEG 8000 treated plants) *indicates a significant difference at the P< 0.05 level,Duncan test(the same as below).

圖2 PEG 8000處理谷子對鄰近非脅迫植物內(nèi)源H2S含量和基因表達的影響 A.縱坐標表示植物葉片H2S含量；B.縱坐標表示H2S響應(yīng)基因的相對表達量；Control.與未處理谷子處于同一玻璃缸內(nèi)的未處理植株；un-PEG.與PEG 8000處理谷子處于同一玻璃缸內(nèi)的未處理植株Fig.2 PEG 8000 treated foxtail millet effects H2S content and gene expression of adjacent non-stressed plants A. The ordinate indicates the H2S content of the plant leaves; B. The ordinate indicates the relative expression of the H2S response gene Control. The untreated plants in the same glass jar as the untreated millet; un-PEG. The untreated plants in the same glass jar as the PEG 8000 treated millet

圖3 PEG 8000處理擬南芥對鄰近非脅迫植物基因表達的影響 A. PEG 8000處理擬南芥Col-0 12 h，同一玻璃缸內(nèi)非脅迫植物H2S響應(yīng)基因相對表達變化；B. PEG 8000處理擬南芥lcd/des1 12 h，同一玻璃缸內(nèi)非脅迫植物H2S響應(yīng)基因相對表達變化；C. PEG 8000處理擬南芥Col-0 12 h，同一玻璃缸內(nèi)非脅迫植物H2S生成酶基因相對表達變化；D. PEG 8000處理擬南芥lcd/des1 12 h，同一玻璃缸內(nèi)非脅迫植物H2S生成酶基因相對表達變化Fig.3 The effect of PEG 8000 treated Arabidopsis on gene expression of adjacent non-stressed plants A. PEG 8000 treatment of Arabidopsis Col-0 12 h, relative expression of H2S response genes in non-stressed plants in the same glass jar; B. PEG 8000 treatment of Arabidopsis lcd/des1 12 h, H2S response gene in non-stress plants in the same glass jar Relative expression changes; C. PEG 8000 treatment of Arabidopsis Col-0 12 h, relative expression of LCD and DES in non-stressed plants in the same glass jar; D. PEG 8000 treatment of Arabidopsis lcd/des1 12 h, relative expression of LCD and DES in non-stressed plants in the same glass jar

2.2 PEG 8000處理谷子對鄰近其它非脅迫植物的H2S含量和基因表達的影響

谷子幼苗經(jīng)PEG 8000處理12 h，檢測同一玻璃缸內(nèi)未處理的谷子、擬南芥(Col-0)、番茄和白菜葉片的H2S含量和H2S響應(yīng)基因表達的影響。結(jié)果表明，與未經(jīng)PEG 8000處理谷子缸內(nèi)的谷子、擬南芥(Col-0)、番茄和白菜相比(圖2A，Control)，經(jīng)40% PEG 8000處理12 h谷子缸內(nèi)的非PEG 8000處理的谷子、擬南芥(Col-0)、番茄和白菜葉片的H2S含量升高(圖2A，un-PEG)。H2S信號分子可以調(diào)節(jié)基因表達參與植物對脅迫的響應(yīng)，選取已經(jīng)報道響應(yīng)H2S的谷子CBL，CaM[27]，擬南芥MPK4，SAT1，RD29A，SAT5[28～29]和白菜FNR1，F(xiàn)C1，LHCB4.3[30]基因進行檢測(圖2B)，與放置在未經(jīng)PEG 8000處理谷子相同缸內(nèi)的植物相比(圖B，Control)，放置在40% PEG 8000處理谷子同一玻璃缸內(nèi)的非處理的谷子、擬南芥(Col-0)和白菜葉片的上述基因表達都升高(圖2B，un-PEG)。

圖4 PEG 8000處理擬南芥對鄰近非脅迫擬南芥氣孔運動的影響 A.縱坐標表示氣孔孔徑(PEG-8000. 40% PEG 8000處理12 h植株；ut-Jar(Col-0).與PEG 8000處理的Col-0處于同一玻璃缸內(nèi)的未處理植株；ut-Jar(lcd/des1).與PEG 8000處理的lcd/des1處于同一玻璃缸內(nèi)的未處理植株 不同字母表示顯著性差異，Duncan test，P<0.05)；B.氣孔顯微鏡觀察Fig.4 The effect of PEG 8000 treated Arabidopsis on stomatal aperture of adjacent non-stressed Arabidopsis A. Ordinate indicates stomatal aperture(PEG-8000. 40% PEG 8000 treated 12 h plant; ut-Jar(Col-0). Untreated plant in the same glass jar as PEG 8000 treated Col-0; ut-Jar(lcd/des1). Untreated plants in the same glass jar as PEG 8000 treated lcd/des1 With different letters indicating significant differences,Duncan test,P<0.05); B.Observation by a stomatal microscope

2.3 PEG 8000處理擬南芥對鄰近非脅迫植物基因表達和氣孔運動的影響

PEG 8000處理谷子引起鄰近植物的內(nèi)源H2S含量和H2S響應(yīng)基因表達變化，利用擬南芥野生型Col-0和H2S產(chǎn)生酶基因LCD和DES1雙突變體lcd/des1對該結(jié)果進行進一步驗證。PEG 8000處理Col-0和突變體lcd/des1植株12 h后，檢測未處理植物的基因表達變化(圖3A)，處于Col-0玻璃缸內(nèi)的未處理白菜，擬南芥(Col-0)和谷子中受H2S調(diào)控的基因均顯著升高(圖3A)，而處于擬南芥lcd/des1相同玻璃缸內(nèi)的未處理植株基因表達變化并不明顯(圖3B)。為了了解鄰近植物內(nèi)源H2S含量升高的原因，檢測其主要的H2S產(chǎn)生酶基因LCD、DES的表達變化。結(jié)果表明，放置在PEG 8000處理的擬南芥Col-0或lcd/des1玻璃缸內(nèi)的未處理植物的LCD、DES基因表達均無顯著性變化(圖3C,D)。

H2S信號分子促進氣孔關(guān)閉，參與植物對干旱脅迫的響應(yīng)[25]，對上述處理條件下的擬南芥Col-0和lcd/des1氣孔孔徑進行觀察。結(jié)果表明，PEG 8000處理12 h的Col-0氣孔孔徑明顯小于對照Col-0，也可導(dǎo)致同一玻璃缸內(nèi)未處理的Col-0和lcd/des1氣孔孔徑減?。籔EG 8000處理12 h的lcd/des1氣孔孔徑小于對照lcd/des1，但不能使同一玻璃缸內(nèi)未處理的Col-0和lcd/des1氣孔孔徑減小(圖4)。

3 討論

植物個體間通過揮發(fā)性物質(zhì)傳遞信息。1983年，Baldwin等報道葉片的機械損傷可導(dǎo)致附近的未受損樹木的酚類和單寧等升高[31]。Dudareva等將已發(fā)現(xiàn)的植物揮發(fā)性物質(zhì)分為四類：萜類化合物、脂肪酸衍生物、苯環(huán)及苯丙烷衍生物和氨基酸衍生物[32]，這些物質(zhì)多數(shù)屬于次級代謝物，可作為信號分子、抗氧化劑等發(fā)揮多種生理或生態(tài)功能。除了植物，這些揮發(fā)性物質(zhì)在動物，細菌及真菌中同樣存在。近十幾年來，NO、CO和H2S等氣體信號分子的相關(guān)研究大量報道，集中于這些分子在細胞內(nèi)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)，外源供體處理提高細胞或個體對脅迫的抵抗等機制研究。植物體細胞內(nèi)的H2S主要由酶催化產(chǎn)生，可被低溫、干旱等脅迫誘導(dǎo)升高，參與后續(xù)的脅迫抵抗和耐受反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，PEG 8000脅迫可引起植物向周圍環(huán)境中釋放H2S，使鄰近非脅迫植株的內(nèi)源H2S含量升高(圖1)，通過對鄰近植株中H2S合成酶基因表達變化的檢測，發(fā)現(xiàn)這些植物中的H2S合成酶基因表達沒有顯著變化，所以鄰近植株內(nèi)源H2S含量升高是由于吸收空氣中的H2S導(dǎo)致，并不是H2S合成酶基因被誘導(dǎo)表達。受脅迫植物釋放的H2S還調(diào)節(jié)鄰近植株的H2S響應(yīng)基因表達(圖2～3)和氣孔運動(圖4)，即H2S不僅可以作為細胞內(nèi)的信號分子發(fā)揮生理調(diào)節(jié)作用，還可以作為植物不同個體間的信息傳遞分子，參與整個植物群體對逆境脅迫的響應(yīng)，為植物“語言”的組成添加了新的“成員”。在本研究的實驗體系中，所使用的玻璃缸容積為7L，檢測到受脅迫植物所在的環(huán)境H2S濃度升高，并且對鄰近植株產(chǎn)生影響，但是在自然條件下，受脅迫植株釋放到環(huán)境中的H2S的量，及H2S的有效作用范圍和作用持續(xù)時間難以檢測，這也是其它種類的綠葉揮發(fā)物需要進一步研究的內(nèi)容。大部分創(chuàng)傷誘導(dǎo)揮發(fā)物或綠葉揮發(fā)物需要通過氣孔進入鄰近植物，而H2S氣體信號分子不只通過氣孔進入植物細胞。此外，茉莉酸甲脂[33]，水楊酸[34]等需要經(jīng)特定的受體激活信號途徑，但H2S無特定的受體分子，目前研究發(fā)現(xiàn)H2S可以對多種蛋白質(zhì)進行翻譯后修飾(S-sulfhydration)，對蛋白質(zhì)的活性進行調(diào)節(jié)[35～36]。

動物個體間通過聲音、行為、氣味等方式傳遞信息，動物個體可以通過不同的音節(jié)組成不同的信息。那植物是否會通過釋放不同的揮發(fā)物組合來達到類似于動物個體信息傳遞中不同音節(jié)的效果，從而實現(xiàn)對不同脅迫的預(yù)警機制？或者通過不同揮發(fā)物組合達到迅速或緩慢傳遞信息的目的？總之，這種植株間的信號交流是植物在長期的進化過程中形成的一種保護機制，對植物個體或群體的生存和繁衍都具有重要的意義。

4 結(jié)論

從本文的研究結(jié)果看來，H2S作為一個氣體信號分子，它不僅可以增強植物自身對于逆境脅迫的抵抗力，還可以作為植株間信息交流的信號分子，向鄰近的健康植株傳遞脅迫預(yù)警信號，使它們提前調(diào)整自身的新陳代謝，以應(yīng)對可能即將來臨的危險，這種植物進化出來的保護機制對植物種群的生存起到至關(guān)重要的作用。