β2微球蛋白在人巨細(xì)胞病毒先天性感染診斷中的價值

華詠艷 于俊才 曹勤

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染在世界范圍內(nèi)普遍存在，一般而言HCMV感染率與經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平呈負(fù)相關(guān)，歐美等發(fā)達(dá)國家感染率約為80%～90%，而發(fā)展中國家感染率高達(dá)100%［1］。HCMV可通過胎盤垂直傳播感染胎兒引起胎兒先天性感染，研究顯示，孕期感染HCMV導(dǎo)致先天性感染的發(fā)生率為15%～45%［2］。HCMV先天性感染患兒可表現(xiàn)為多種臨床癥狀，包括小頭畸形、腦室周鈣化、感音神經(jīng)性耳聾、紫癜、黃疸、肝炎、肺炎、腎炎等。HCMV先天性感染根據(jù)病毒在體內(nèi)的復(fù)制狀態(tài)分為活動性感染和潛伏感染；根據(jù)是否有臨床癥狀可將先天性感染分為癥狀性先天感染和非癥狀性先天感染，癥狀性先天感染需根據(jù)后遺癥的嚴(yán)重情況決定是否需采取抗病毒治療。由于現(xiàn)在常用的HCMV治療藥物（如更昔洛韋等）多存在毒副作用，使用需謹(jǐn)慎。因此，先天性感染還需要區(qū)分活動性感染與潛伏感染。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2017年1月—2018年10月本院新生兒科住院患兒作為研究對象。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，對患兒采取的檢測得到過患兒監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.2 儀器與試劑 ABI 7300Plus定量PCR系統(tǒng)（Life Technologies公司），試劑為CMV-DNA檢測試劑盒（達(dá)安基因公司）；西門子BNⅡ特定蛋白分析儀，試劑盒為西門子β2微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）測定試劑盒；DT5-4B低速臺式離心機(jī)（北京時代北利離心機(jī)有限公司）。

1.3 檢測方法 采用帶惰性分離膠的真空采血管分別抽取新生兒的空腹靜脈血4 mL，靜置10 min，4 000 r/min離心5 min（離心半徑10 cm），分離血清，-20 ℃保存。清潔患兒外陰，用無菌尿液收集袋收集新生兒尿液3～5 mL立即送檢。

1.3.1 HCMV病毒核酸（HCMV-DNA）檢測 采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測患兒尿液中HCMV-DNA，按試劑盒說明書操作：取2 mL尿液于離心管中，12 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），棄上清。在沉淀中加入DNA提取液100 μL，100 ℃孵育10 min，12 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm）后取上清5 μL作為PCR模板。PCR條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s、55 ℃、40 s，共40個循環(huán)。根據(jù)陽性參考品CT值制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣本中HCMV病毒拷貝數(shù)。以無菌水作為陰性對照檢測20次，計(jì)算均值及標(biāo)準(zhǔn)差，以均數(shù)加20倍標(biāo)準(zhǔn)差為陽性檢測臨界值。

1.3.2 β2-MG水平檢測 采用散射比濁法檢測患者血清β2-MG水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間均值比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析HCMV-DNA和β2-MG單項(xiàng)檢測效能并確定臨界值，ROC曲線下面積（area under curve，AUC）＞0.5為有診斷意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共136例患兒。其中男性62例，女性74例；平均年齡（16±9.2）d?；純盒詣e、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。先天性感染組76例，非感染組60例。先天性感染患兒中癥狀性先天性感染組36例，非癥狀性先天性感染組40例。

2.2 HCMV拷貝數(shù) 癥狀性先天性感染組HCMV拷貝數(shù)明顯高于非癥狀性先天性感染組（拷貝數(shù)/mL：307 786±133 626比18 934±5 688，P＜0.01），與國外研究結(jié)果一致，提示病毒拷貝數(shù)的高低能在一定程度上預(yù)示是否會發(fā)生癥狀性感染。同時40例非癥狀性先天性感染組患兒中，有10例（占25.0%）盡管病毒拷貝數(shù)已超過20 000 拷貝數(shù)/mL，但仍無相應(yīng)臨床表現(xiàn)；36例癥狀性先天性感染組患兒中，有7例（占19.44%）盡管病毒拷貝數(shù)低于300 拷貝數(shù)/mL，但卻出現(xiàn)臨床癥狀。再次證實(shí)了HCMV拷貝數(shù)在判斷是否發(fā)生癥狀性感染以及是否給予抗病毒治療的策略制定上存在缺陷。見圖1。

圖1 非癥狀性先天性感染組與癥狀性先天性感染組的HCMV-DNA拷貝數(shù)比較

2.3 β2-MG含量 HCMV先天性感染組血清β2-MG含量明顯高于非感染組（mg/L：3.143±0.230比2.122±0.130，P＜0.01）。見表1，圖2。癥狀性先天性感染組β2-MG水平明顯高于非癥狀性先天性感染組（mg/L：4.413±0.291比1.964±0.144，P＜0.01）。見表2，圖3。非感染組血清β2-MG水平較非癥狀性感染組高（mg/L：2.122±0.130比1.964±0.144，P＜0.01），這是由于血清β2-MG含量的變化還受其他因素干擾，如其他原因所致腎炎、肺炎等。

表1 先天性感染組與非感染組血清β2-MG水平比較（±s）

表1 先天性感染組與非感染組血清β2-MG水平比較（±s）

注：與非感染組比較，aP＜0.01

β 2-M G（m g/L）組別 例數(shù)（例）先天性感染組 7 6 3.1 4 3±0.2 3 0 a非感染組 6 0 2.1 2 2±0.1 3 0

表2 癥狀性先天性感染組與非癥狀性先天性感染組血清β2-MG水平比較（±s）

表2 癥狀性先天性感染組與非癥狀性先天性感染組血清β2-MG水平比較（±s）

注：與非癥狀性先天性感染組比較，aP＜0.01

組別 例數(shù)（例）β 2-M G（m g/L）癥狀性先天性感染組 3 6 4.4 1 3±0.2 9 1 a非癥狀性先天性感染組 4 0 1.9 6 4±0.1 4 4

圖2 先天性感染組與非感染組的β2-MG水平比較

圖3 癥狀性先天性感染組與非癥狀性先天性感染組的血清β2-MG水平比較

2.4 HCMV-DNA拷貝數(shù)和β2-MG對癥狀性先天性感染的診斷價值 ROC曲線分析顯示，HCMVDNA拷貝數(shù)、β2-MG診斷癥狀性先天性感染的AUC分別為0.644 2和0.949 2。HCMV病毒核酸拷貝數(shù)作為診斷是否會發(fā)生癥狀性感染的指標(biāo)，其臨界值為＞6 221 拷貝數(shù)/mL，敏感度為61.54%，特異度為67.86%；而β2-MG作為診斷是否會發(fā)生癥狀性感染的指標(biāo)，其臨界值為＞2.935 mg/L，敏感度為88.46%，特異度為89.29%。見表3，圖4。

表3 HCMV-DNA拷貝數(shù)和β2-MG診斷癥狀性先天性感染的價值

圖4 HCMV-DNA拷貝數(shù)和β2-MG診斷癥狀性先天性感染的ROC曲線

3 討論

我國HCMV先天性感染十分常見，新生兒發(fā)病率約為1%，出生時早期診斷顯得尤為重要。目前針對HCMV先天性感染的診斷主要依據(jù)體液（尤其是尿液）樣本中HCMV拷貝數(shù)，主要采用熒光定量法檢測病毒核酸。但臨床實(shí)際遇到的困難是，有些患兒即使尿液中病毒拷貝數(shù)較高，卻仍不表現(xiàn)為癥狀性感染；而有些患兒盡管尿液中病毒拷貝數(shù)不高，但卻表現(xiàn)出嚴(yán)重的HCMV感染癥狀。有些癥狀很容易被觀察到，還有許多表現(xiàn)為漸進(jìn)性（如感音神經(jīng)性耳聾），早期很難預(yù)測，最終是否會出現(xiàn)嚴(yán)重的后遺癥由病毒對各組織器官的損害程度決定。

HCMV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病毒分離、PCR、抗原血癥等［3］，而能夠用于臨床實(shí)際診斷HCMV活動性先天性感染主要為pp65抗原血癥、實(shí)時PCR酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測病毒特異免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）。pp65抗原血癥采用間接免疫熒光法檢測患者血液中單核細(xì)胞是否存在HCMV pp65抗原，該方法耗時約4 h，且結(jié)果觀察依賴于操作人員的經(jīng)驗(yàn)。熒光定量PCR是最近新發(fā)展的一項(xiàng)快速檢測HCMV的方法，可以定量樣本中病毒的含量。HCMV先天性感染患兒尿液中的病毒滴度與患兒是否發(fā)生癥狀性感染呈正相關(guān)［4］。IgG只能證明存在感染，而判斷是否為活動性感染需雙份血清抗體含量4倍以上升高；IgM陽性可診斷為活動性感染，但其陽性率極低，且受患者免疫狀態(tài)的影響結(jié)果可出現(xiàn)假陰性。

有研究表明，新生兒尿液中HCMV拷貝數(shù)與患兒是否發(fā)生癥狀性感染之間有明顯的相關(guān)性，病毒拷貝數(shù)越高，患兒發(fā)生癥狀性感染的概率越大［5］。然而采用病毒拷貝數(shù)診斷HCMV癥狀性先天感染存在兩個方面缺陷：① 部分患兒即使在出生時尿液中病毒拷貝數(shù)很高，但仍無相應(yīng)臨床癥狀［6］；② 病毒在尿路上皮細(xì)胞等細(xì)胞中大量復(fù)制時有時會產(chǎn)生非感染性顆粒（non-infectious envelope particles，NIEP），這是一些不包含病毒核酸的“假病毒”，通過熒光定量PCR無法測出［7］。為解決這一臨床實(shí)際問題，本研究通過加入非病毒特異性指標(biāo)β2-MG以診斷HCMV癥狀性先天感染。有研究顯示，HCMV先天性感染患兒的血液中β2-MG呈高表達(dá)。

β2-MG廣泛分布于淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面，機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時β2-MG合成釋放增多。HCMV先天性感染可導(dǎo)致肺炎、腎炎等多種炎癥［8-9］，同時上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等是HCMV復(fù)制的主要宿主細(xì)胞，而病毒的包膜來自宿主細(xì)胞膜，其包膜上含有大量β2-MG，當(dāng)病毒在上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞中大量復(fù)制并以出芽方式釋放時［10-12］，血液中β2-MG含量會顯著升高。

臨床用于治療HCMV先天性感染的藥物以更昔洛韋等核苷類似物為主，這些藥物都存在一定毒副作用，對嬰幼兒的發(fā)育會產(chǎn)生影響。這對早期干預(yù)治療提出了更高的要求，非感染性包膜顆粒（noninfectious enveloped particles，NIEP）的存在使病毒核酸檢測存在不確定性，故HCMV特異的蛋白指標(biāo)是理想選擇，但由于目前臨床應(yīng)用HCMV pp65抗原血癥檢測耗時長，結(jié)果判斷存在主觀性，因此僅在極少數(shù)大型醫(yī)院開展。本研究通過檢測HCMV感染的非病毒特異性指標(biāo)β2-MG，發(fā)現(xiàn)β2-MG可以彌補(bǔ)核酸檢測在敏感度和特異度上的缺陷，聯(lián)合β2-MG檢測可以較大程度地提高檢測敏感度和特異度。