呂國英,張作法*,陳建飛,毛榮良,劉世柱
(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,浙江 杭州 310021; 2.衢州菇樂農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,浙江 衢州 324000;3.常山縣森力家庭農(nóng)場,浙江 常山 324200; 4.浙江方格藥業(yè)有限公司,浙江 慶元 323800)
猴頭菇(Hericiumerinaceus)又名猴頭菌、刺猬菌,是一種大型的食藥用真菌,因其形狀酷似金絲猴頭,而得名。猴頭菌的食用歷史悠久,營養(yǎng)豐富,主要活性成分有多糖、低聚糖、萜類和酚類等,具有抗癌、護(hù)胃、提高免疫力等多種藥理功效[1-2]。有關(guān)猴頭菇的功能性成分研究中,多糖護(hù)胃活性最受關(guān)注[3],猴頭菇的抗氧化活性研究較少。
自由基是在生物體內(nèi)呈游離狀態(tài)帶有不成對電子的分子、原子或離子。大量研究表明,氧自由基誘導(dǎo)的LPO反應(yīng)與許多疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系[4]。因此,尋找利于人體吸收的能清除體內(nèi)過量自由基的外源活性自由基清除劑,成為人們關(guān)注的重點(diǎn)。本研究以抗氧化活性為指標(biāo),選取不同品種不同成熟度猴頭菇子實(shí)體,制備出具有優(yōu)良抗氧化活性的提取物,同時為猴頭菇功能食品的開發(fā)提供了參考。
猴頭菇1號、2號、99號不同生長時期的子實(shí)體由常山縣森力家庭農(nóng)場提供。DPPH、ABTS、過硫酸鉀購自Sigma,其他試劑為分析純。
選取猴頭菇1號、2號、99號3個品種不同生長時期的子實(shí)體(A未成熟,B成熟,C過熟),60 ℃烘干粉碎過60目篩,備用。
取3.0 g猴頭細(xì)粉,加入100 mL 70%乙醇,90 ℃回流1 h,離心收集上清液,殘渣再次加入100 mL 70%乙醇,再次回流1 h。合并提取液,10 000 r·min-1離心5 min,取上清液旋蒸,得到醇提物,4 ℃下保存。測定時,取醇提物用70%乙醇配制成1~5 mg·mL-1的樣品待測液。
1 mL樣品待測液加入1 mL 0.01%的DPPH乙醇溶液,振蕩反應(yīng)30 min后,在517 nm處測定吸光度。以70%乙醇溶液代替同樣體積的樣品作為空白,計算DPPH清除率[5]。
配制7 mol·L-1ABTS儲備液(2.46 mol·L-1過硫酸鉀溶液溶解ABTS),室溫避光條件下靜置12~16 h;將ABTS以磷酸緩沖液(10 mmol·L-1,pH值7.4)稀釋,使其吸光度在734 nm處達(dá)到0.70±0.02。然后取2.5 mL的ABTS+測定液,加入1.0 mL的樣品待測液,準(zhǔn)確振蕩30 s,在734 nm處測定吸光度,計算ABTS+清除率[6]。
1 mL樣品加入1 mL FeSO4(12 mmol·L-1),再加入1 mL H2O2(12 mmol·L-1),37 ℃下保溫10 min,再加入1 mL 6 mmol·L-1水楊酸,37 ℃下保溫30 min,然后10 000 r·min-1,4 ℃下離心10 min,取上清液在510 nm處測定吸光度。以70%乙醇溶液代替同樣體積的樣品作為空白,計算羥自由基清除率[7]。
取0.4 mL樣品,加入1 mL 0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液,再加入1 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混合液于50 ℃下水浴20 min,加入1 mL 10%三氯乙酸后,4 ℃下1 000g離心10 min,取2 mL上清液,加入0.2 mL 0.1%三氯化鐵溶液中,于700 nm處測定吸光度,吸光度值大則表示還原力強(qiáng)[8]。
當(dāng)DPPH自由基與抗氧化劑反應(yīng)后,會隨著還原而逐漸褪色,在517 nm處的吸光度降低。由表1可以看出,3種猴頭菇的醇提物隨著濃度的增大,DPPH自由基清除能力增強(qiáng),不同成熟度的子實(shí)體提取物的DPPH自由基清除率在未成熟時都表現(xiàn)出最高,5 mg·mL-1時,99號的清除率最高為59.5%,明顯優(yōu)于2號的清除率(48.7%)。黃越等[9]提取猴頭的粗多糖對清除DPPH自由基的研究表明,當(dāng)粗多糖濃度為5 mg·mL-1時,3種多糖A-HeP、U-HeP和W-HeP對DPPH自由基的清除率分別為71.67%、55.12%和47.91%。實(shí)驗(yàn)表明,猴頭菇中一些小分子物質(zhì)與多糖等大分子同樣具有抗氧化效果。
表1 樣品DPPH自由基清除率
含抗氧化成分的樣品與ABTS+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色。ABTS+的最大吸收波長 734 nm處檢測吸光度的變化,可測定樣品對ABTS+自由基的清除能力。猴頭菇提取物對ABTS自由基的清除作用見表2。1號品種表現(xiàn)出優(yōu)秀的清除能力,不同成熟度的子實(shí)體提取物在2 mg·mL-1時的清除率均超過了95%,99號提取物在3 mg·mL-1的清除率也超過了95%,2號的ABTS+自由基的清除能力略遜于前兩者。吳美媛等[10]比較猴頭菇的不同溶劑提取物的ABTS+自由基的清除能力,猴頭菇熱水、乙醇及丙酮提取物2 mg·mL-1對ABTS+自由基的清除率分別為52.06%、63.84%,49.59%。說明不同品種與提取試劑對抗氧化作用有明顯的差異。
表2 樣品ABTS+清除率
H2O2和Fe2+混合產(chǎn)生羥自由基,在體系內(nèi)加入水楊酸,可捕捉羥自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì),該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收。加入抗氧化物質(zhì),會與水楊酸形成競爭,使有色產(chǎn)物的生成量減少,通過吸光度的變化評價羥自由基的清除能力。猴頭菇提取物對羥自由基的清除能力見表3。3種猴頭菇的醇提物隨著濃度的增大清除能力增強(qiáng),不同品種之間的清除率有較大的差別,99號品種在高濃度時羥自由基清除率在60.9%~70.8%,2號品種的清除率相對最弱,為23.7%~35.8%,但不同成熟度之間的清除能力沒有明顯的規(guī)律。
表3 樣品羥自由基清除率
還原能力是反映物質(zhì)抗氧化活性的一個重要指標(biāo),還原力與抗氧化活性呈正相關(guān),還原能力越大,抗氧化活性越高。表4表明,猴頭菇醇提物濃度為1~5 mg·mL-1時,還原力隨著濃度的升高快速增強(qiáng),呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性,2號不同成熟度的還原能力都優(yōu)于1號和99號。何晉浙等[11]在研究不同產(chǎn)地的猴頭菇多糖的還原力時,當(dāng)多糖濃度為5 mg·mL-1,其在700 nm處的吸光度都在0.55以下。Kozarski等[12]對靈芝多糖還原能力進(jìn)行研究,當(dāng)濃度為5 mg·mL-1時,其在700 nm處的吸光度的僅為0.23。說明猴頭菇醇提物具有良好的還原能力。
表4 樣品還原能力
本研究以體外藥理活性為導(dǎo)向,比較了不同品種猴頭菇在不同成熟度時子實(shí)體70%乙醇提取物的體外抗氧化能力,以DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基的清除率和還原力為指標(biāo)。研究結(jié)果表明,不同品種的猴頭菇提取物均具有良好的抗氧化能力,但有較大的差別。1號和99號品種對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率優(yōu)于2號;2號品種的還原能力最強(qiáng);99號品種的羥基清除能力最高。研究結(jié)果為猴頭菇保健品開發(fā)提供了思路和參考。