川貝母鱗莖組織培養(yǎng)過程中褐化的控制初探

王曉，蘇娟，李昆華，韓鄲，張萬巧，岳健*

(1.云南山里紅生物科技有限公司，云南 昆明 6502228； 2.云南青谷生物科技有限公司，云南 昆明 650225)

川貝母(FritillariacirrhosaD. Don)為百合科貝母屬多年生草本植物，《中華人民共和國藥典》(2015版一部)收載的藥材川貝的基源品種之一，主要分布于西藏、云南、四川和青海等海拔1 800～4 200 m的高寒區(qū)域[1-2]。川貝母具有清熱潤肺、化痰止咳、散結(jié)消痛的功效[3]，用于肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞嗽、痰中帶血等，具有止咳圣藥之稱[4]，中藥處方用量巨大，加上生境特殊且種子休眠期長、自然萌發(fā)率低、野生資源過度采挖等原因[3]，川貝母資源不斷減少，已被列入國家三級保護(hù)植物名單[2]，并且來源物種已被《國家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄》收錄[4]。

相較于傳統(tǒng)的繁殖方法，利用組織培養(yǎng)繁殖川貝母能節(jié)省育苗用地、提高繁殖系數(shù)、縮短育苗周期、維持母種的優(yōu)良性狀[5]，對挽救川貝母處境和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。目前，對川貝母的組織培養(yǎng)已有報(bào)道[5-7]，但是鮮見關(guān)于褐化現(xiàn)象的研究報(bào)道[8]。外植體菌類污染、玻璃化、褐化現(xiàn)象已經(jīng)成為制約藥用植物組織培養(yǎng)發(fā)展的重要因素，并稱為藥用植物組織培養(yǎng)三大瓶頸，其中，褐化問題涉及方面復(fù)雜[9-10]。本研究以川貝母鱗莖為外植體，通過比較消毒方式、培養(yǎng)條件、褐化抑制劑對川貝母組培褐化影響程度，為川貝母組織培養(yǎng)中控制褐化現(xiàn)象和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)川貝母組培苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

川貝母外植體來源于云南山里紅生物科技有限公司瀘西分公司種植基地，于9月至10月取當(dāng)年生鱗莖。

1.2 方法

1.2.1 外植體準(zhǔn)備

采集新鮮野生川貝母鱗莖，用流水沖洗60 min，用洗潔精晃搖清洗5 min，在超凈臺上消毒處理，無菌水充分清洗，無菌濾紙吸干水分，切成 0.5 cm×0.5 cm的塊狀[11-13]，接種至培養(yǎng)基，每瓶接種1個鱗莖塊，每個處理接種10瓶，重復(fù)3次。

1.2.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有激素6-BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1、瓊脂6 g·L-1，pH值為5.8；光照強(qiáng)度為1 500～2 500 lx，光照周期12 h·d-1，培養(yǎng)溫度(25±2)℃；光照培養(yǎng)箱為上海一恒MGC-100；培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)外植體褐化率和組培苗獲得率。

1.3 處理設(shè)計(jì)

1.3.1 消毒方式

設(shè)置3個處理：1，75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理10 min；2，75%乙醇處理30 s，再用2%次氯酸鈉處理10 min；3，0.1% HgCl2處理5 min，再用2%次氯酸鈉處理5 min。

1.3.2 消毒時間

設(shè)置6個處理：1，75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理5 min；2，75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理6 min；3，75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理7 min；4，75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理8 min；5，75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理9 min；6，75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理10 min。

1.3.3 培養(yǎng)條件

在超凈臺上用75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理10 min；消毒后接種培養(yǎng)基，設(shè)置3個處理：1，光照周期8 h·d-1、溫度(25±2)℃，暗周期16 h·d-1、溫度(15±2)℃；2，光照周期12 h·d-1、溫度(25±2)℃，暗周期12 h·d-1、溫度為15±2 ℃；3，光照周期16 h·d-1、溫度(25±2)℃，暗周期8 h·d-1、溫度(15±2)℃。

1.3.4 不同抑制劑處理

在超凈臺上用75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理10 min；消毒后接種，設(shè)置5個處理：在培養(yǎng)基中分別添加2 g·L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、200 mg·L-1抗壞血酸(VC)、2 mg·L-1檸檬酸(CA)、300 mg·L-1硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、2 g·L-1活性炭(AC)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

褐化率(%)=褐化株數(shù)/接種總數(shù)×100；獲得率(%)=有效株數(shù)(未污染未褐化)/接種總數(shù)×100。數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 21.0軟件分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式處理的效果

以清洗后不做任何消毒處理的川貝母鱗莖接種培養(yǎng)作為空白對照，由表1可知，在相同消毒時間和培養(yǎng)條件下，處理組川貝母鱗莖外植體的褐化程度均大于空白對照組，在所有處理中，采用75%乙醇處理30 s，再用2%次氯酸鈉處理10 min的消毒方式對川貝母鱗莖組織培養(yǎng)過程中的褐化情況控制較好，褐化率最低，但組培苗獲得率也較低；采用0.1% HgCl2處理5 min，再用2%次氯酸鈉處理5 min獲得率最高，可見HgCl2的滅菌消毒作用強(qiáng)于次氯酸鈉和乙醇，而導(dǎo)致褐化的嚴(yán)重程度則為HgCl2>乙醇>次氯酸鈉。

表1 不同消毒方式處理對川貝母組培褐化和獲得率的影響

注：同列無相同小寫字母表示組間差異顯著。表2～4同。

2.2 不同消毒時間處理的效果

將川貝母鱗莖進(jìn)行清洗后，在超凈臺上用75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理不同時間，統(tǒng)計(jì)外植體的褐化率和組培苗獲得率，通過目視法對褐化程度進(jìn)行觀察并記錄結(jié)果，結(jié)果見表2。隨著HgCl2處理時間的延長，其褐化率和褐化程度呈遞增趨勢；用0.1% HgCl2處理9、10 min時組培苗獲得率在最大，但與處理8 min時的獲得率無顯著差異。培養(yǎng)至第20天時，所有處理均出現(xiàn)有褐化現(xiàn)象，到第30天褐化程度均有加深，0.1% HgCl2處理8 min及以內(nèi)褐化程度較輕。

表2 不同消毒時間對組培褐化率、獲得率和褐化程度的影響

注：—，未出現(xiàn)褐化現(xiàn)象；+，輕度褐化；++，中度褐化；+++，嚴(yán)重褐化。

2.3 不同培養(yǎng)條件處理的效果

以接種后于光照周期12 h·d-1，暗周期12 h·d-1，溫度均為(25±2)℃條件下培養(yǎng)作為空白對照組，與空白對照組相比，變溫處理試驗(yàn)組的外植體褐化率均顯著降低，獲得率均顯著提高，光照時間越長，褐化率越低，獲得率越高(表3)。川貝母為高寒山區(qū)生長植物，在低溫環(huán)境下生長較為適宜，同時，低溫環(huán)境較好地抑制了川貝母中多酚氧化酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶等與褐化相關(guān)的酶活性。

2.4 不同抑制劑處理的效果

由表4可知，培養(yǎng)基中添加不同抑制劑對組培褐化現(xiàn)象均有較好的抑制效果，獲得率也均有提高。培養(yǎng)基中添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)時，褐化率最低，獲得率最高；添加抗壞血酸(VC)、檸檬酸(CA)和活性炭(AC)的試驗(yàn)組褐化率與獲得率無顯著差異。由于VC和CA對植物生長有一定的促進(jìn)作用，而AC在吸附褐化物質(zhì)的同時也會吸附植物生長所需營養(yǎng)物質(zhì)，因此，添加AC的試驗(yàn)組中出現(xiàn)了種苗壞死現(xiàn)象。

表3 不同培養(yǎng)條件對組培褐化和獲得率的影響

表4 不同抑制劑處理對組培褐化和獲得率的影響

3 小結(jié)與討論

在植物組織培養(yǎng)過程中，褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生有很多因素決定，包括外植體的生理狀態(tài)和部位、取材的時間和大小、預(yù)處理的方式、培養(yǎng)的條件和因素、褐化抑制劑的種類，以及繼代轉(zhuǎn)瓶的頻率等，通常通過相應(yīng)的手段來控制植物組織培養(yǎng)過程中的褐化率[14-18]。本研究以誘導(dǎo)率最高的鱗莖作為外植體[17]，研究不同因素對川貝母組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象的影響，結(jié)果表明，試驗(yàn)所用滅菌消毒試劑均能加重受傷外植體的褐化程度，同時，隨著消毒滅菌時間的延長，褐化率和褐化程度均有明顯的增強(qiáng)，這與庾韋花等[15]的結(jié)論一致：隨著消毒劑處理時間的延長，褐化率升高。本研究添加的抑制劑均能降低褐化率，其中，添加聚乙烯吡咯烷酮的處理外植體褐化率最低。低溫處理可以明顯降低川貝母組織培養(yǎng)過程的褐化率，這與王躍華等[19]和趙伶俐等[20]的結(jié)論一致。綜上，考慮川貝母組培苗的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展方向，以鱗莖作為川貝母組織培養(yǎng)外植體，采用HgCl2和次氯酸鈉消毒滅菌8 min，置于添加PVP的培養(yǎng)基中，于光照周期8 h·d-1、溫度(25±2)℃，暗周期16 h·d-1、溫度(15±2)℃條件下培養(yǎng)，能夠較好地控制川貝母鱗莖組織培養(yǎng)過程中的褐化率，同時提高組培植株的獲得率。

本研究發(fā)現(xiàn)，川貝母外植體接種20 d之后才會出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，增殖階段的褐化率高于前期，而變溫培養(yǎng)能夠明顯推遲褐化的發(fā)生，降低褐化率，同時促進(jìn)川貝母鱗莖的組織培養(yǎng)過程，并且溫度的變化對川貝母外植體褐化控制的影響程度較其他因素明顯。筆者也對培養(yǎng)基成分、濃度、外植體種類進(jìn)行了對比試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的成分和濃度對川貝母鱗莖的褐化率影響較??；以莖段、葉片、針形幼苗作為外植體均不同程度出現(xiàn)褐化，褐化率差異不明顯，而誘導(dǎo)率差異較明顯。本研究中空白對照組的褐化率也不低，推測是由于對外植體的切割處理造成了傷口，而傷口的存在會提高褐化出現(xiàn)的概率[9]，因此，后期可以考慮使用完整鱗莖接種進(jìn)行組織培養(yǎng)，以降低褐化概率。