普境安對細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵的作用效果

郝力力，陽愛國，袁東波，郭莉，侯巍，莫茜，尹杰，張朝輝，徐林，余勁，王瀟，何能杰，李銳

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041； 2.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；3.甘孜州動物疫病預(yù)防控制中心，四川 甘孜 626000； 4.河南普愛飼料股份有限公司，河南 商水 466100；5.成都杰鑫瑪生物科技有限公司，四川 成都 610041； 6.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

四川省甘孜州是全世界包蟲病高發(fā)地區(qū)，包蟲病不僅嚴(yán)重危害當(dāng)?shù)鼐用窠】担覍?dǎo)致很多包蟲病患者所在家庭因病返貧，嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)厣鐣?jīng)濟(jì)的發(fā)展。細(xì)粒棘球絳蟲屬于圓葉目，犬科動物(家犬、流浪犬、狼、狐)是終末宿主和唯一傳染源[1-2]。成蟲在犬科動物小腸內(nèi)發(fā)育成熟，排出蟲卵，蟲卵內(nèi)含六鉤蚴，對人和其他中間宿主(牛、羊)具有感染力。值得注意的是，細(xì)粒棘球絳蟲的蟲卵對外界不良環(huán)境抵抗力很強(qiáng)，尤其耐受低溫：-80 ℃ 7 d方能徹底滅活，7 ℃可存活200 d以上，21 ℃可存活50 d[3-4]。甘孜州大部分地區(qū)屬亞寒帶高原氣候，全年氣溫偏低，日照長，晝夜溫差大，非常適合環(huán)境中細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵的長期存活。此外，甘孜州全州總計18個縣，牧業(yè)縣占比高，牧民家家養(yǎng)犬，陽性犬只的糞便極易污染牧場、地表水源以及周邊居住環(huán)境，導(dǎo)致人畜容易從環(huán)境中攝入蟲卵而感染包蟲病。因此，鑒于上述情況，迫切需要一種高效的消毒劑，對環(huán)境中的蟲卵進(jìn)行抑制殺滅，降低人畜攝入蟲卵的風(fēng)險，保障當(dāng)?shù)鼐用竦慕】怠?/p>

普境安(Stalosan F)是由丹麥Stormollen公司研發(fā)的一款干粉生物安全衛(wèi)生產(chǎn)品，對各種病原微生物均有較好的殺滅抑制效果。該產(chǎn)品采用特殊的加工工藝，將所有成分加工到接近納米級微粒再進(jìn)行結(jié)合，最終產(chǎn)品呈超微粒狀態(tài)。普境安可采用專門的噴灑設(shè)備，按照所需覆蓋面積來計算所用劑量，均勻覆蓋于物體表面，可強(qiáng)力吸附環(huán)境中的病原體，從而徹底破壞微生物的生存環(huán)境，達(dá)到抑制、殺滅病原微生物的目的[5]。普境安對人畜無任何副作用，已上市50多年，對雞球蟲、豬蛔蟲等寄生蟲蟲卵、蒼蠅蟲卵、真菌(曲霉菌、黃曲霉菌等)、細(xì)菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等)和病毒(禽流感、藍(lán)耳病、犬細(xì)小病毒和豬細(xì)小病毒等)均有較好的控制效果[6]。因此，本實驗擬就普境安對細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵的抑制、殺滅效果展開初步研究，確定普境安能否有效地殺滅細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵或者減低蟲卵的活力，從而為提高包蟲病流行地區(qū)公共衛(wèi)生水平、保障當(dāng)?shù)鼐用窠】堤峁┘夹g(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

主要儀器設(shè)備和試劑。臺式高速離心機(jī)(eppendorf 5402型)、ABI7500熒光PCR儀、Nanodrop 2000、TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix(北京全式金公司)、Trizol(Invitrogen)，引物和探針由華大基因合成。

犬糞樣本的采集。于2017年9月，在石渠縣采集驅(qū)蟲后3 d內(nèi)的新鮮家犬糞便30份，每份150 g左右，4 ℃冷藏保存。

1.2 處理設(shè)計

陽性犬糞的篩選。將30份犬糞每份均充分混勻，每份取100 mg按照Trizol說明書提取總RNA備用。針對細(xì)粒棘球絳蟲ND1基因，設(shè)計合成以下引物和探針(MGB)：Pf: 5′-TGTACTGGTTGG GGTGGTTACAA-3′；Pr:5′-GCCTCAAACCTAACAG ATCCAAAA-3′；Probe: 5′-CACATCGAACAGACCT T-3′。采用上述引物和探針，建立如下PCR反應(yīng)體系：上下游引物各3 μL(終濃度600 nmol·L-1)、探針1 μL(終濃度400 nmol·L-1)、PCR Mix 12.5 μL、RNA 3～4 μL(10 ng)、ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。于ABI7500熒光PCR儀上運行反應(yīng)，選取Ct值小于20的犬糞樣本備用。

普境安對蟲卵最佳作用效果對應(yīng)劑量和處理時間的確定。選取Ct值小于20的犬糞樣本1份，將普境安分為50、80和100 g·m-23個劑量組，處理時間分別為4、8、12和24 h，同時設(shè)置1個空白對照組(未用普境安處理)，總計4個實驗組(圖1)。每組取犬糞6 g，均勻平攤于90 mm無菌平皿內(nèi)，按照對應(yīng)劑量將普境安均勻覆蓋于犬糞上，溫箱內(nèi)18 ℃下放置。在4個時間點，每組分別取大約1 g犬糞提取總RNA，按照上述反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，做3個復(fù)孔，確定Ct值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0對不同處理組和空白對照組的Ct值進(jìn)行卡方分析，判定是否存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

結(jié)果如表1所示，對照組在4、8、12和24 h Ct值變化區(qū)間為18.32～19.45，無明顯變化；和對照組相比，50 g·m-2劑量組4個時間段Ct值無明顯變化；80 g·m-2劑量組在12和24 h有明顯變化，其中作用24 h后差異顯著(P<0.05)；100 g·m-2劑量組在作用8、12和24 h后Ct值有明顯變化，其中作用12和24 h后差異極顯著(P<0.01)。

表1 不同普境安處理組作用不同時間后對應(yīng)的Ct值

注：*、**分別表示與對照相比差異達(dá)到顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平。

3 討論

普境安對寄生蟲蟲卵的抑制機(jī)理主要為以下2方面：1)其納米級成分(硅酸鹽成分)可滲透至蟲卵內(nèi)部，改變其內(nèi)部的pH值，從而干擾DNA的復(fù)制，切斷了幼蟲的發(fā)育過程；2)普境安顆粒改變了蟲卵表面的通透性，造成了內(nèi)部水分的流失，蟲卵脫水死亡，達(dá)到了抑制和殺滅的作用。Permin等[6]將普境安處理過的雞蛔蟲、雞異刺線蟲和封閉毛細(xì)線蟲的蟲卵接種雞后，和未處理組相比，雞體內(nèi)成蟲數(shù)量明顯減少，說明普境安對蟲卵有亞致死作用，能夠一定程度上抑制蟲卵發(fā)育為感染性幼蟲。Ralph等[7]發(fā)現(xiàn)，采用50 g·m-2劑量作用于未孢子化的堆型艾美耳球蟲卵囊48 h后，和對照組相比，孢子化率下降了50%。

本實驗中發(fā)現(xiàn)，100 g·m-2作用24 h后，犬糞中細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵ND1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，表明對蟲卵活力有顯著的抑制作用。甘孜州18個縣均為包蟲病流行區(qū)域，前期相關(guān)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，土壤、犬被毛上均檢出蟲卵[7]，因此，采用普境安對定居點周邊土壤、草場以及人活動的廣場等重點區(qū)域進(jìn)行消毒，是降低人畜感染包蟲的有效措施。細(xì)粒棘球絳蟲的蟲卵與球蟲、蛔蟲蟲卵(需要在外界環(huán)境中進(jìn)行發(fā)育：球蟲孢子化，蛔蟲蟲卵進(jìn)一步分裂，有明顯的形態(tài)變化)不同，排出到外界環(huán)境中時就已經(jīng)發(fā)育成熟，形態(tài)上不再有明顯變化，因此，無法直接從形態(tài)上判定普境安對蟲卵的抑制效果。在后續(xù)研究中，可從犬糞中分離富集細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵，按照不同劑量/時間組合作用后，接種中間宿主綿羊，依據(jù)綿羊體內(nèi)臟器上包囊個數(shù)及發(fā)育程度來進(jìn)一步確定普境安最佳劑量/作用時間組合。由于細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵對人和家畜有感染性，因此，對綿羊的攻蟲實驗至少需要在BSL-2實驗室進(jìn)行，這也是目前未能開展動物實驗的主要原因。

由于普境安的特殊作用機(jī)制，即使長期使用，病原微生物也不會產(chǎn)生抗藥性；和其他消毒劑不同，普境安即使在有機(jī)物存在的條件下，也能充分發(fā)揮作用，而且可以進(jìn)行帶畜消毒，對人畜無害(吸入、食入、皮膚接觸及眼部接觸均無害)，不會產(chǎn)生生態(tài)破壞，非常適合包蟲病流行地區(qū)使用。到目前為止，普境安對細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵殺滅抑制效果國內(nèi)尚無相關(guān)報道，本實驗進(jìn)行了前期研究，以期為包蟲病的防控提供行之有效的技術(shù)措施。