曼氏無(wú)針烏賊神經(jīng)肽sCAP基因克隆與組織表達(dá)定位

李 穎 周宇鑫 單雨菡 黃 偉 劉慧慧 平洪領(lǐng) 史會(huì)來(lái) 遲長(zhǎng)鳳

(1. 浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，海洋生物種質(zhì)發(fā)掘與利用國(guó)家地方聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，舟山 316022; 2. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所，舟山 313021)

神經(jīng)肽是調(diào)節(jié)動(dòng)物生理活動(dòng)的小分子多肽[1]。大量研究表明神經(jīng)肽在許多軟體動(dòng)物特別是頭足綱動(dòng)物的生理調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[2]。然而, 目前關(guān)于頭足類神經(jīng)肽的研究主要集中在如GnRH、FaRPs和APGWamide等小分子多肽方面[3], 而在生理調(diào)節(jié)過(guò)程中意義重大的小分子肽——小心激肽(Small cardioactive peptide, sCAP)的研究較少。sCAP在刺激心臟運(yùn)動(dòng)[4]、控制肌肉收縮[5]、輸卵管收縮、增強(qiáng)后腸收縮[6]及生物蛻皮等生理過(guò)程中有重要作用[7]。sCAP最初發(fā)現(xiàn)于長(zhǎng)蛸(Octopus minor)的腦組織中, 有Ocp-1、Ocp-2、Ocp-3和Ocp-4四種類型[8]。其相關(guān)類似物oct-SCPRP也被發(fā)現(xiàn)于真蛸(Octopus vulgaris)中, 具有收縮齒舌牽拉肌的作用[9]。有研究表明Ocp-1和Ocp-2是非洲大蝸牛(Achatina fulica)中Achatin-1的同源基因產(chǎn)物, Ocp-1可通過(guò)影響脈紅螺(Rapana venosa)中谷氨酸含量刺激心臟收縮[3,10]。綜上, 開展sCAP及其生理功能研究具有重要意義。

曼氏無(wú)針烏賊(Sepiella japonica)是一種具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的經(jīng)濟(jì)頭足類, 曾經(jīng)是東?！八拇蠛．a(chǎn)”之一[11]。20世紀(jì)70年代以后, 曼氏無(wú)針烏賊種質(zhì)資源出現(xiàn)衰退, 產(chǎn)量明顯下降, 為保護(hù)這一珍貴物種, 開展其人工繁育就顯得尤為重要[12]。本研究團(tuán)隊(duì)在前期大量研究的基礎(chǔ)上, 采用cDNA末端快速克隆的技術(shù)(RACE)克隆獲得曼氏無(wú)針烏賊sCAP基因的cDNA全長(zhǎng)序列并開展生物信息學(xué)分析；采用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)研究sCAP基因在曼氏無(wú)針烏賊雌性和雄性個(gè)體不同組織中表達(dá)的差異性；采用原位雜交(in situhybridization, ISH)技術(shù)對(duì)曼氏無(wú)針烏賊sCAP基因mRNA在腦組織中進(jìn)行細(xì)胞定位, 進(jìn)而推測(cè)sCAP基因在曼氏無(wú)針烏賊中的可能生理功能, 并為曼氏無(wú)針烏賊的種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)選取性成熟時(shí)期的健康、活力強(qiáng)的曼氏無(wú)針烏賊(80—100 g)[13], 從浙江溫州蒼南頭足類苗種繁育基地取樣, 活體解剖心、腦、視葉、肌肉、胰、胃、腸、肝、鰓、性腺(精巢和卵巢)、纏卵腺和副纏卵腺等組織于裝有RNA保存液(CWBIO公司)的凍存管中保存, 用干冰運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后-80℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。體外解剖成熟曼氏無(wú)針烏賊的完整腦組織, 立即于暗處置于預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液中固定過(guò)夜, 然后將組織轉(zhuǎn)移至75%乙醇溶液中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

總RNA提取以及cDNA第一條鏈的合成曼氏無(wú)針烏賊各個(gè)組織總RNA使用RNAiso Plus(TaKaRa公司)進(jìn)行提取。2 μg總RNA用于cDNA第一條鏈的合成, 實(shí)驗(yàn)方法參照M-MLV(Rnase H-)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)說(shuō)明書方法進(jìn)行。

曼氏無(wú)針烏賊sCAP基因核心序列的克隆根據(jù)NCBI已有的商烏賊(Sepia officinalis, AFS32 691.1)和真蛸(AB198190.1)的sCAP基因序列, 設(shè)計(jì)曼氏無(wú)針烏賊sCAP基因核心片段的簡(jiǎn)并引物, 見表 1中sCAP-F/sCAP-R。

采用25 μL PCR體系根據(jù)PremixTaq試劑(TaKaRa公司)說(shuō)明書進(jìn)行, PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海華大基因進(jìn)行測(cè)序。

曼氏無(wú)針烏賊sCAP基因cDNA全長(zhǎng)的克隆根據(jù)SjsCAP的核心序列設(shè)計(jì)5′ RACE(sCAP-5′outer/sCAP-5′ inner, 表 1)和3′RACE(sCAP-3′outer/sCAP-3′ inner, 表 1)的引物。全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增根據(jù)SMARTTMRACE試劑盒(TaKaRa公司)說(shuō)明書進(jìn)行, PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、連接、轉(zhuǎn)化最后將菌液送至上海華大基因測(cè)序。

表 1 克隆sCAP基因所用引物Tab. 1 Primers used in sCAP gene cloning

曼氏無(wú)針烏賊sCAP基因cDNA全長(zhǎng)序列分析及生物信息學(xué)分析采用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接分析, 獲得SjsCAP基因的全長(zhǎng)序列；在NCBI上預(yù)測(cè)其ORF區(qū)；利用在線軟件Expasy-ProtParam (http://we-b.expasy.org/protparam/)[14]將其翻譯為氨基酸序列并預(yù)測(cè)蛋白的相對(duì)分子量和等電點(diǎn)；采用TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)sCAP跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用SignalIP[15](http://www.cbs.dtu.dk/service/SignalP/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列中的信號(hào)肽, 利用NetNGly 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測(cè)蛋白的糖基化位點(diǎn)；利用NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)蛋白的磷酸化位點(diǎn)；利用ClustalX[16]將Sjs-CAP與已知物種的心激肽基因氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)；用MrBayes v3.2.6軟件[17]采用貝葉斯推理的方法(BI)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

曼氏無(wú)針烏賊sCAP基因的組織表達(dá)特異性分析選取成熟烏賊的組織：腦、視葉、心、鰓、肝、胃、胰、腸、肌肉、性腺(精巢和卵巢)、纏卵腺、副纏卵腺。雌雄各選擇3只烏賊做3次生物學(xué)重復(fù), 每個(gè)個(gè)體的每個(gè)組織的定量表達(dá)做3次機(jī)械重復(fù)。選擇曼氏無(wú)針烏賊β-actin基因(JN56 4496.1)作為內(nèi)參, 通過(guò)qRT-PCR的方法對(duì)SjsCAP基因的組織表達(dá)特異性進(jìn)行分析, 選取肌肉組織作為最小參照, 采用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量, 數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析及T檢驗(yàn), 處理組之間的顯著性差異(P＜0.05), 用Origin8制圖軟件繪制圖表。引物信息見表 2。

各種組織的總RNA提取和cDNA第一鏈合成的方法采用實(shí)驗(yàn)方法中所述。400 ng的cDNA模版用于qRT-PCR, 加樣體系及反應(yīng)條件按照SYBR Premix ExTaqTMII Kit (TaKaRa公司)產(chǎn)品說(shuō)明書操作。

曼氏無(wú)針烏賊神經(jīng)肽sCAP基因腦組織表達(dá)定位分析sCAP原位雜交探針以烏賊腦組織cDNA為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增, 純化的探針模板根據(jù)探針標(biāo)記試劑盒(DIG RNA Labeling kit SP6 /T7 kit, 羅氏)說(shuō)明書進(jìn)行探針標(biāo)記。正義探針與反義探針制作方法相同引物為A1F/A1R和B1F/B1R(表 2), 正義探針作為對(duì)照組。將成熟曼氏無(wú)針烏賊腦組織采用4%多聚甲醛固定過(guò)夜, 采用不同濃度酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后, 蛋白酶K 37℃處理20min。組織切片在42℃雜交液中預(yù)雜交1h, 同樣溫度下與探針雜交過(guò)夜, 10% Blocking溶液室溫封閉1h, 加1∶500稀釋的二抗Anti-DIG-AP 4℃過(guò)夜, 在室溫下NBT/BCIP染色30min, 封片, Olympus CX31顯微鏡下觀察拍照。

表 2 SjsCAP熒光定量和原位雜交引物Tab. 2 Primers of SjsCAP used for qRT-PCR and in situ hybridization assay

2 結(jié)果

2.1 曼氏無(wú)針烏賊sCAP基因cDNA全長(zhǎng)分析

曼氏無(wú)針烏賊神經(jīng)肽sCAP基因cDNA全長(zhǎng)696 bp, 由111 bp的5′ 非編碼區(qū)(UTR)、編碼86個(gè)氨基酸的261 bp開放閱讀框(ORF)和324 bp的3′-UTR組成, 預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子量(MW)為9.331 kD,等電點(diǎn)(pI)為8.52。通過(guò)在線軟件對(duì)該蛋白進(jìn)行生物學(xué)信息分析, 該蛋白具有信號(hào)肽在1—20號(hào)氨基酸位點(diǎn)；含有一個(gè)跨膜區(qū)域, 7—29號(hào)氨基酸為跨膜區(qū)域, 含有1個(gè)糖基化位點(diǎn)在5號(hào)位點(diǎn)；含有6個(gè)絲氨酸(Ser)位點(diǎn), 位于3、7、23、35、72和79號(hào)位點(diǎn), 3個(gè)蘇氨酸(Thr)位點(diǎn), 位于18、22和76號(hào)位點(diǎn),1個(gè)酪氨酸(Tyr)位點(diǎn), 位于24號(hào)位點(diǎn)。

2.2 曼氏無(wú)針烏賊sCAP同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹建立

從NCBI選取商烏賊(AFS32691.1)、加州雙斑蛸(Octopus bimaculoides, XP_014771607.1)、真蛸(BAE66649.1)、海蝸牛(Aplysia californica, XP_012943902.1)以及太平洋牡蠣(Crassostrea gigas,NP_001292304.1)的sCAP基因氨基酸序列與曼氏無(wú)針烏賊sCAP基因氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比, 結(jié)果表明曼氏無(wú)針烏賊sCAP基因與商烏賊同源性最高達(dá)到90%, 與加州雙斑蛸及真蛸的同源性分別為66%和54%, 與海蝸牛及長(zhǎng)牡蠣的同源性低于40%。我們?cè)贜CBI中選取了54條已知與sCAP基因有相同功能的其他物種的心激肽氨基酸同源序列, 基于貝葉斯推理方法進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建, 在建樹時(shí)建立4個(gè)馬爾可夫鏈, 每100代進(jìn)行一次抽樣, 共運(yùn)行200萬(wàn)代,計(jì)算后驗(yàn)概率(Posterior probability)。結(jié)果表明與曼氏無(wú)針烏賊親緣關(guān)系最近的是商烏賊, 其次是加州雙斑蛸和真蛸, 與海蝸牛以及太平洋牡蠣等軟體動(dòng)物匯聚為一大支, 與果蠅屬等節(jié)肢動(dòng)物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖 1)。

2.3 曼氏無(wú)針烏賊sCAP基因組織表達(dá)特異性分析

SjsCAP在成熟雌雄個(gè)體各個(gè)組織中均有一定量表達(dá), 其中在視葉中表達(dá)量最高, 腦次之, 在雄性內(nèi)臟器官胰臟中表達(dá)量也較高。在雄性個(gè)體中, 視葉和腦與其他組織中SjsCAP表達(dá)量具有顯著性差異(用abc表示)；在雌性個(gè)體中視葉的表達(dá)量最高且與其他組織有顯著性差異。在雌性與雄性視葉組織之間SjsCAP表達(dá)量也有顯著性差異, 且雄性視葉組織的表達(dá)量是雌性的3.4倍。在雌性與雄性腦組織之間SjsCAP表達(dá)量也有顯著性差異, 且雄性腦組織的表達(dá)量是雌性的4.5倍(圖 2)。

2.4 曼氏無(wú)針烏賊神經(jīng)肽sCAP基因腦組織表達(dá)定位分析

利用原位雜交技術(shù)對(duì)曼氏無(wú)針烏賊sCAP基因mRNA在腦組織中的表達(dá)位點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞定位。如圖 3所示, 在烏賊腦組織的多個(gè)區(qū)域均能觀察到清晰的sCAP基因mRNA陽(yáng)性雜交信號(hào), 而用正義探針進(jìn)行雜交的圖 3A中不能觀察到信號(hào)。烏賊腦組織的3個(gè)部分組成：食道上神經(jīng)團(tuán)、食道下神經(jīng)團(tuán)和視葉[11]。在曼氏無(wú)針烏賊腦的食道上神經(jīng)團(tuán)的垂直葉及亞垂直葉均能觀察的陽(yáng)性雜交信號(hào)(圖3B)；在背外側(cè)葉、視腺及腦腳葉也可以觀察到陽(yáng)性雜交信號(hào)(圖 3C)；在視葉細(xì)胞中也可觀察到較強(qiáng)的陽(yáng)性雜交信號(hào)(圖 3D—F)。

3 討論

圖 1 基于SjsCAP同源氨基酸序列構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Bayesian methods evolutionary trees based on SjsCAP homologous amino acid sequences后驗(yàn)概率表示在分支節(jié)點(diǎn), 所有氨基酸序列號(hào)來(lái)自于GenBankPosterior probability is indicated by numbers at the nodes, all protein sequences were obtained from GenBank

本研究首次克隆得到曼氏無(wú)針烏賊的sCAP基因的cDNA全長(zhǎng)序列, 通過(guò)對(duì)該基因的生物學(xué)信息分析, 我們推測(cè)該蛋白是由細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外調(diào)節(jié)各項(xiàng)生理功能。這些生物信息學(xué)分析與蛋白定位、生理功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)[18]。通過(guò)qRT-PCR表達(dá)分析,sCAP的表達(dá)在雄性及雌性曼氏無(wú)針烏賊的視葉中被明顯檢測(cè)到, 其次是腦,可以推測(cè)sCAP是通過(guò)控制曼氏無(wú)針烏賊的神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)控制其活動(dòng)。sCAP在纏卵腺及副纏卵腺中微量表達(dá)說(shuō)明其可能與輸卵管的收縮功能有關(guān)[19]。從表達(dá)量分析, 雄性個(gè)體的表達(dá)量明顯高于雌性個(gè)體, 表達(dá)量最顯著的視葉組織雄性的表達(dá)量與雌性之間也有顯著性差異, 可能因?yàn)椴煌詣e的組織差異性導(dǎo)致的, 推測(cè)該基因在控制雌雄個(gè)體生理活動(dòng)時(shí)可能存在性別差異, 還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。有研究學(xué)者用RT-PCR的方法對(duì)昆蟲中的甲殼類心激肽(Crustacean cardioactive peptide, CCAP)進(jìn)行了研究, 結(jié)果顯示其在不同發(fā)育階段都有表達(dá), 表達(dá)最多的是在幼蟲到蛹過(guò)渡的階段[20]。表達(dá)水平波動(dòng)在幾個(gè)發(fā)育階段的過(guò)程中, 直到發(fā)育后期一些細(xì)胞依然沒(méi)有表達(dá)[20,21], 細(xì)胞內(nèi)刺激識(shí)別的神經(jīng)元可以引起心臟運(yùn)動(dòng)加速[22,23]。因此,sCAP在曼氏無(wú)針烏賊中不同時(shí)期的表達(dá)量將作為下一步研究工作。有研究表示小心激肽SCP在靜水椎實(shí)螺(Lymnaea stagnalis)的內(nèi)臟和右頂葉神經(jīng)節(jié)以及左側(cè)頂葉神經(jīng)節(jié)中有免疫反應(yīng)性[24,25]。有研究表明在煙草天蛾(Manduca sexta)腦中觀察到9對(duì)細(xì)胞被CCAP原位探針標(biāo)記[26], 同時(shí)采用RT-PCR、免疫組化和原位雜交技術(shù)在東方果蠅(Bactrocera dorsalis)[27]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[23]、水蚤(Daphnia longicephala)[28]、長(zhǎng)紅錐蝽(Rhodnius prolixus)[29]的中樞神經(jīng)系統(tǒng)檢測(cè)到CCAP的表達(dá)。本文的研究結(jié)果也在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào), 與上述研究結(jié)果一致。

圖 2 雄性和雌性曼氏無(wú)針烏賊sCAP不同組織表達(dá)特異性Fig. 2 The relative SjsCAP mRNA level in various tissues of male and female S. japonica

圖 3 曼氏無(wú)針烏賊sCAP基因mRNA的腦組織原位雜交Fig. 3 In situ hybridization of sCAP mRNA in brain of S. japonicaA. 正義探針對(duì)照(視葉); B. 垂直葉(VL), 亞垂直葉(SVL), 食道(OES); C. 背外側(cè)葉(DLL), 視腺(OG), 腦腳葉(PL); D. 視葉; E. 視葉(OL); F. 視葉細(xì)胞(40倍鏡); 黑色尖頭指示陽(yáng)性區(qū)域, 標(biāo)尺長(zhǎng)度標(biāo)注在圖片右下角A. a medial sagittal section of the anterior basal lobe stained with the sense sCAP probe; B. vertical lobe (VL), subvertical lobe (SVL),esophagus (OES); C. dorsolateral lobe (DLL), optic gland (OG), peduncle lobe (PL); D. optic lobe; E. optic lobe (OL); F. optic lobe cells for 10×40 times. The black arrows indicate positive signals. Scale bars in the lower right corner of the picture

目前有關(guān)于心激肽的研究主要集中在甲殼類、昆蟲類以及腹足類。黑化誘導(dǎo)神經(jīng)肽(Corazonin)是從美洲大蠊(American cockroach)中被發(fā)現(xiàn)的, 研究表明它可以刺激心臟加速運(yùn)動(dòng)[30]；CAPs和CAP2是存在于昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng), 也同樣具有刺激心臟運(yùn)動(dòng)的功能[31], CAP2還參與胚胎發(fā)育中腸道運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)[32]；SCP和SCPB被稱為小心激肽, 它們不僅可以刺激心臟運(yùn)動(dòng)[4,33], 還可以控制肌肉的收縮[5]；LCP被稱為大心激肽, 研究表明它可能具有刺激心臟運(yùn)動(dòng)的作用[34]；CCAP最初是從三葉真蟹(Carinus maenas)的圍心器官中被發(fā)現(xiàn)的[35], 它不僅可以刺激心臟運(yùn)動(dòng)和參與滲透壓調(diào)節(jié)和淡水適應(yīng)性[23],還參與生物的蛻皮[7]、刺激輸卵管收縮[6]、增強(qiáng)后腸的收縮[26]、控制肌肉的收縮、調(diào)節(jié)包括視覺和嗅覺在內(nèi)的各種神經(jīng)系統(tǒng)的功能[7], 此外還具有作為脂肪動(dòng)力激素釋放因子的作用[6]和調(diào)節(jié)口腔胃神經(jīng)節(jié)等功能[36]。此外, 分離純化于海兔心臟的心激肽(NdWFamide)能夠通過(guò)激活G蛋白途徑提高海兔心室肌細(xì)胞的L-型Ca2+流[37]；首次分離于羅馬蝸牛(Helix pomatia)中的軟體動(dòng)物的CCAP相關(guān)肽(MCCAP)是靜水椎實(shí)螺口腔攝食網(wǎng)絡(luò)潛在的外部調(diào)節(jié)器[38]；頭足類中的商烏賊CCAPs通過(guò)參與輸卵管中卵的轉(zhuǎn)運(yùn)和卵囊物質(zhì)的機(jī)械分泌來(lái)參與產(chǎn)卵調(diào)控, 進(jìn)一步的免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 商烏賊CCAP定位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和與卵膜合成和分泌相關(guān)腺體的神經(jīng)末梢、下食道神經(jīng)團(tuán)[39]。

綜上所述, 本文所研究的曼氏無(wú)針烏賊心激肽sCAP是首次通過(guò)基因克隆的方法在烏賊中獲得其基因cDNA全長(zhǎng), 通過(guò)多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)與其他近緣物種有保守的進(jìn)化關(guān)系, 組織特異性表達(dá)說(shuō)明其在不同組織表達(dá)可能與多種功能相關(guān), 原位雜交實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在曼氏無(wú)針烏賊腦中的表達(dá)部位可能是控制該基因的功能區(qū)域。今后我們會(huì)對(duì)該基因的細(xì)胞定位以及生理功能驗(yàn)證方面開展深入研究。