鐵皮楓斗多糖對小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用

羅 群，沈先榮*，侯登勇，何 穎，蔣定文，王慶蓉，陳 偉

（第二軍醫(yī)大學(xué)海軍醫(yī)學(xué)研究所，上海 200433 ）

肝臟是體內(nèi)消化、代謝、排泄、解毒和免疫等過程的重要器官[1]，其結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜，易受病原體、有毒物質(zhì)、免疫病理等累及。酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是長期大量飲酒所致的肝臟疾病，近年來ALD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，酒精已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損害的第二大病因[2]。急性酒精性肝損傷是ALD的早期表現(xiàn)，酒精及其代謝產(chǎn)物會引起脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等，對肝組織造成損害[3-4]。

中草藥多糖具有抗氧化功能，可抑制脂質(zhì)過氧化所致的肝細(xì)胞直接損傷，還可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制脂肪肝的發(fā)生[5-6]。鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛的新鮮或干燥莖，鮮鐵皮石斛剪去部分須根后，經(jīng)炒制扭成螺旋形，烘干后成品習(xí)稱鐵皮楓斗。據(jù)《中國藥典》中記載，“石斛，性寒，味甘、淡、微咸，人胃、腎經(jīng)，具有益胃生津，滋陰清熱的功效”[7]。多糖是鐵皮石斛的主要有效成分，能夠清除自由基，具有抗氧化活性[8-10]，可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[11-12]，防治亞健康，減少疾病的產(chǎn)生，抑制腫瘤，延緩衰老[13-14]。袁慧琦等[15]研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛對酒精性肝損傷具有一定的治療作用，而其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)肝臟組織中凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。聶春艷等[16]研究表明霍山石斛水溶性多糖可在血清肝功能、脂質(zhì)代謝以及肝組織酒精代謝酶和抗氧化體系等方面共同干預(yù)和恢復(fù)酒精性肝損傷。黃靜等[17]研究發(fā)現(xiàn)霍山石斛多糖對CCl4致小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、抑制腫瘤壞死因子-α表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過水提法提取鐵皮楓斗多糖，觀察其對急性酒精性肝損傷動物的血液及肝組織相關(guān)生化指標(biāo)的影響，并檢測肝組織病理變化，研究鐵皮楓斗多糖對急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性ICR小鼠（體質(zhì)量18～22 g）由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-0016。

鐵皮楓斗由上饒致誠實(shí)業(yè)有限公司提供，經(jīng)鑒定為蘭科植物鐵皮石斛的干燥莖。取鐵皮楓斗水提物，溶解于蒸餾水中作為受試藥，4 ℃冷藏保存。

聯(lián)苯雙酯滴丸（批號13010102，溶解于蒸餾水中作為陽性試劑，4 ℃冷藏保存） 北京協(xié)和藥廠；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate amino transferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，ALT）、甘油三酯（triglyceride，TG）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒 南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申勝生物技術(shù)有限公司；759型紫外分光光度計(jì)、759型紫外-可見分光光度計(jì) 上海奧普勒儀器有限公司；酶標(biāo)儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 鐵皮楓斗多糖的提取

稱取20 g鐵皮楓斗，在中藥粉碎機(jī)中粉碎后，加入裝有1 000 mL蒸餾水的圓底燒瓶中，75 ℃水浴中攪拌加熱4.5 h，過濾離心除渣后取得水提液。將水提液用鹽酸調(diào)至pH值為3，利用等電點(diǎn)沉淀法去除雜蛋白，4 ℃靜置過夜后，采用500 mL離心管11 680×g離心30 min，取上清液，加入4 倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，4 ℃靜置過夜，再采用500 mL離心管11 680×g離心30 min，得沉淀。在鼓風(fēng)干燥箱中于40 ℃條件下干燥至恒質(zhì)量，得到水提固形物3.28 g（白色粉末狀），得率為16.4%。采用硫酸-蒽酮比色法測定固形物中的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為81.0%。

1.3.2 動物分組與給藥

將小鼠隨機(jī)分為6 組，每組10 只，設(shè)空白對照組、模型組、陽性對照組（灌胃150 mg/kg mb聯(lián)苯雙酯）及鐵皮楓斗多糖高、中、低劑量組。高、中、低劑量以《中華人民共和國藥典（一部）》石斛干品的人體（體質(zhì)量以60 kg計(jì)）推薦攝入量（6～12 g/d）中值（10 g/d）的5、10、30 倍為依據(jù)，計(jì)算出每組小鼠的給藥劑量。依據(jù)小鼠體質(zhì)量，各劑量組的每日給藥量分別為：高劑量組0.05 g/（10 g mb）、中劑量組0.016 7 g/（10 g mb）、低劑量組0.008 3 g/（10 gmb）。石斛多糖組與陽性對照組每日按10 mL/kg劑量灌胃小鼠一次，空白對照組和模型組小鼠給予相同體積蒸餾水，每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃14 d，按體質(zhì)量調(diào)整灌胃量。末次給藥2 h后，除空白對照組外，其余各組按12 mL/kg一次性灌胃體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，禁食不禁水，12 h后再灌胃一次，空白對照組給予相應(yīng)體積蒸餾水，最后一次灌胃后12 h處死小鼠。

1.3.3 血液指標(biāo)測定

小鼠摘眼球取血，血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）含量、紅細(xì)胞比容（hematocrit，HCT）、紅細(xì)胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV）、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）含量和血紅蛋白（hemoglobin，HGB）質(zhì)量濃度；血液靜置后1 040×g離心10 min分離血清，按照試劑盒說明測定血清TG濃度及ALT、AST活力。

1.3.4 肝組織指標(biāo)測定

取血后處死小鼠，迅速取出肝臟，稱質(zhì)量，測定動物肝臟指數(shù)（肝臟指數(shù)/（mg/g）＝肝臟質(zhì)量/mg/體質(zhì)量/g）；另精確稱取小鼠肝臟左葉相同部位組織100 mg，生理鹽水制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%肝勻漿，530×g低溫離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明測定肝組織TG濃度、SOD、GSH-Px活力，二喹啉甲酸法測定蛋白含量。

取小鼠肝臟左葉處小塊組織，用10%福爾馬林試劑固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色，制成切片，用普通光學(xué)顯微鏡觀察肝細(xì)胞變性程度、壞死及炎癥改變等。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 ±s表示。組間差異分析采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對急性酒精性肝損傷小鼠血相指標(biāo)的影響

表1 鐵皮楓斗多糖對急性酒精性肝損傷小鼠血相的影響（n= 10）Table 1 Effects of Dendrobium candidum polysaccharides on hemogram in mice with acute alcoholic liver injury (n= 10)

如表1所示，由于大量攝入酒精后，小鼠發(fā)生炎癥反應(yīng)，同時也會發(fā)生失水，與空白對照組相比，模型組小鼠血液的紅細(xì)胞和白細(xì)胞含量都顯著增高（P＜0.05），給藥組中，各劑量組的紅細(xì)胞含量相對于模型組都顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），相對于空白對照組無顯著性差異；各劑量組白細(xì)胞含量相對于模型組都有下降，而中劑量組的白細(xì)胞含量相對于模型組顯著降低（P＜0.05）。

2.2 對急性酒精性肝損傷小鼠血清指標(biāo)的影響

脂質(zhì)過氧化作用是酒精對肝損傷的一種主要方式[18]，大量飲酒會激活氧分子，產(chǎn)生氧化自由基，導(dǎo)致肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，改變肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。ALT和AST是肝細(xì)胞內(nèi)兩種重要的轉(zhuǎn)氨酶，小鼠在急性酒精性肝損傷時，肝細(xì)胞中的ALT和AST會進(jìn)入血液中，使血清ALT和AST水平升高[19]。

表2 鐵皮楓斗多糖對急性酒精性肝損傷小鼠血清TG、ALT和AST水平的影響（n=10）Table 2 Effects of Dendrobium candidum polysaccharides on the level of TG, ALT and AST in serum of alcohol-treated mice (n= 10)

如表2所示，模型組小鼠血清中TG、ALT、AST的水平都顯著高于空白對照組（P＜0.05，P＜0.01），可見，急性酒精性肝損傷模型建模成功。各劑量組小鼠血清中的TG濃度都顯著低于模型組（P＜0.05），高劑量組中小鼠血清ALT活力顯著低于模型組（P＜0.05），低劑量組中小鼠血清A S T活力顯著低于模型組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鐵皮楓斗多糖對急性酒精性肝損傷具有防護(hù)作用。

2.3 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響

肝臟受到酒精性損傷時會出現(xiàn)肝細(xì)胞呈水樣變性而腫大；在出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂時，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪堆積，導(dǎo)致脂肪變性，使肝細(xì)胞體積腫大，質(zhì)量增加；而當(dāng)肝細(xì)胞微管受損，分泌功能障礙時，會導(dǎo)致分泌性蛋白貯留，出現(xiàn)氣球樣變性，肝臟指數(shù)升高。肝臟受到損傷，肝臟指數(shù)會發(fā)生明顯變化，肝臟指數(shù)可反映肝臟的病變情況。

表3 鐵皮楓斗多糖對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響（n= 10）Table 3 Effects of Dendrobium candidum polysaccharides on liver index of alcohol-treated mice (n= 10)

如表3所示，模型組小鼠的肝臟指數(shù)極顯著高于空白對照組（P＜0.01），說明模型組酒精性肝損傷嚴(yán)重，造模成功。各劑量組小鼠的肝臟指數(shù)均低于模型組，中劑量組與模型組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，鐵皮楓斗多糖對急性酒精性肝損機(jī)體具有一定的防護(hù)作用。

2.4 對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織指標(biāo)的影響

乙醇在大量進(jìn)入機(jī)體后，在乙醇脫氫酶的催化下大量脫氫氧化，會抑制肝細(xì)胞內(nèi)脂肪酶活性，引起三羧酸循環(huán)障礙，脂肪酸氧化減弱，影響脂肪代謝，導(dǎo)致脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積[20]。乙醇在機(jī)體中產(chǎn)生過量活性氧會破壞機(jī)體的氧化-抗氧化平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激使肝細(xì)胞內(nèi)非酶抗氧化物大量消耗，對SOD、GSH-Px等抗氧化酶造成損傷，引起肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷肝細(xì)胞[21]；因此，肝細(xì)胞內(nèi)TG、SOD、GSH-Px水平可反映酒精性肝損傷程度。

表4 鐵皮楓斗多糖對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織TG、SOD和GSH-Px水平的影響（n=10）Table 4 Effects of Dendrobium candidum polysaccharides on the level of TG, SOD and GSH-Px of liver tissue of alcohol-treated mice (n= 10)

如表4所示，模型組小鼠肝組織的TG含量顯著高于空白對照組（P＜0.05），各劑量組小鼠肝組織的TG含量低于模型組，中、高劑量組與模型組相比具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。模型組小鼠肝組織的SOD和GSH-Px活力極顯著低于空白對照組（P＜0.01），各劑量組小鼠肝組織SOD和GSH-Px活力高于模型組，中劑量組與模型組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.5 對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響

如圖1所示，在空白對照組中小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)正常、排列整齊、分界清楚、大小均勻，細(xì)胞核大而圓，核質(zhì)分布均勻，核仁清晰。模型組小鼠肝細(xì)胞普遍濁腫、排列紊亂，出現(xiàn)以肝細(xì)胞變性、壞死或細(xì)胞核固縮溶解，大量炎性細(xì)胞浸潤。各劑量組及陽性對照組小鼠肝細(xì)胞病理損傷明顯減輕，肝細(xì)胞排列比較整齊，肝細(xì)胞腫脹、變性壞死程度減輕，壞死灶區(qū)明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤程度也明顯較低。

圖1 小鼠肝組織病理學(xué)顯微鏡圖（200×）Fig. 1 Pathological changes of liver tissues（200 ×）

3 討 論

過量飲酒已成為世界范圍內(nèi)發(fā)病及死亡的重要原因之一，也是導(dǎo)致急性和慢性肝臟疾病的一個主要原因[22-23]。酒精性肝損傷是酒精誘導(dǎo)的以機(jī)體肝臟為主要受損靶器官的應(yīng)激反應(yīng)，是復(fù)雜的病理生理過程[24]。過量飲酒會引起機(jī)體酒精代謝酶活性、抗氧化能力和脂質(zhì)代謝異常，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞的功能損傷，造成肝細(xì)胞內(nèi)TG大量聚集[25]，SOD和GSH-Px水平下降，膜結(jié)構(gòu)破壞、通透性改變[26]，使得存在于肝細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶（ALT和AST）從細(xì)胞逸出，進(jìn)入血液循環(huán)，此時血清ALT、AST水平較正常生理?xiàng)l件升高[27]，ALT、AST水平是臨床醫(yī)學(xué)上檢查肝功能的重要指標(biāo)，常用來判斷肝臟是否受到損傷。目前，酒精性肝損傷發(fā)病機(jī)制尚不完全清晰，尚無公認(rèn)的有效治療手段，尋找能夠治療酒精性肝損傷的藥物成為研究的一個熱點(diǎn)[28-29]。

多糖作為食源性功能因子，是抗酒精性肝損傷的一類重要物質(zhì)[30]，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抗氧化功能，能夠抑制肝損傷的發(fā)生[31-32]。鐵皮石斛是一種珍貴的中藥材，多糖是鐵皮石斛的主要活性成分[33]。鐵皮石斛多糖是一種天然乙?；嗵荹34]，具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗氧化等多種功效。本實(shí)驗(yàn)通過灌胃過量酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷，檢測小鼠血清中的TG、AST、ALT水平及肝組織中的TG、SOD、GSH-Px水平，結(jié)果表明，模型組與空白對照組間的各檢測指標(biāo)存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），因此，急性酒精性肝損傷造模成功。相對于模型組，給藥（鐵皮楓斗多糖）后小鼠血清和肝組織中的TG濃度顯著降低（P＜0.05），說明鐵皮楓斗多糖具有改善酒精導(dǎo)致的肝組織脂質(zhì)代謝異常的作用；同時，中劑量給藥組中小鼠肝組織中的SOD和GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05），因此，鐵皮楓斗多糖可有效維持肝組織的抗氧化體系平衡狀態(tài)，減輕酒精引發(fā)的肝組織氧化損傷；小鼠血清中的AST、ALT活力也顯著降低（P＜0.05），提示鐵皮楓斗多糖可改善肝細(xì)胞膜通透性和流動性，減少肝功能損傷。通過肝組織的病理觀察發(fā)現(xiàn)，給藥（鐵皮楓斗多糖）后可明顯減輕小鼠肝細(xì)胞病理損傷。因此鐵皮楓斗多糖對酒精致小鼠急性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，在食品保健和治療藥物方面有較廣闊的開發(fā)前景。