雞傳染性支氣管炎病毒感染無特定病原體雞后氣管黏膜掃描電鏡觀察

彭芳珍,王書揚(yáng),佘銳萍,胡艷欣,靳 紅

(1.安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽 安慶 246052;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技教育司,北京 朝陽(yáng) 100026)

雞傳染性支氣管炎(IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的雞的一種急性高度接觸性傳染病,主要侵害雞的呼吸、泌尿生殖和消化系統(tǒng)等,可導(dǎo)致不同日齡的雞發(fā)生不同程度的危害。IBV往往引起復(fù)合感染(如新城疫、慢性呼吸道病等),并可繼發(fā)細(xì)菌性疾病如大腸桿菌病、沙門菌病等,從而加重了對(duì)雞群的危害。IBV是危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的主要疫病之一[1-4],國(guó)內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)每年因該病導(dǎo)致直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)億元人民幣。為了從微觀水平觀察接種IBV后雛雞氣管黏膜結(jié)構(gòu)的變化,本研究選取接種IBV后不同日齡的氣管下段組織進(jìn)行了掃描電鏡觀察,試驗(yàn)結(jié)果為IBV的發(fā)病機(jī)理的研究提供了形態(tài)學(xué)證據(jù),進(jìn)而為IB的綜合防治提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 IBV毒株 M41株,由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病與微生物教研室提供,ELD50=10-5.63/0.1 mL。

1.2 飼料 雛雞全價(jià)飼料,購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)震亞飼料廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 80只14日齡無特定病原體動(dòng)物(Specific Pathogen Free,SPF)白來航雞,購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。隨機(jī)平均分為對(duì)照組和試驗(yàn)組。

1.4 主要設(shè)備 日立HCP-2臨界點(diǎn)二氧化碳干燥儀;離子濺射儀日立IB-5;日立S-570掃描電鏡。

1.5 樣品的準(zhǔn)備 試驗(yàn)組雛雞用M41株尿囊液滴鼻點(diǎn)眼,0.3 mL/只。攻毒后5 d和7 d分別取試驗(yàn)組和對(duì)照組各5只雞,頸靜脈放血處死,采取氣管下1/3段,在2.5%戊二醛-多聚甲醛混合固定液中充分固定后,備用。對(duì)試驗(yàn)組死亡雞只及時(shí)剖檢,觀察、記錄大體病理變化。

1.6 掃描電鏡樣品的制作 掃描電鏡樣品具體的制作過程如下：取已經(jīng)固定好的樣品,修成大小為1 mm3左右的小塊;PBS(0.1 mol/L,pH值7.4～7.6)沖洗;鋨酸(1%)后固定1 h;PBS(0.1 mol/L,pH值7.4～7.6)沖洗3×5 min;用梯度乙醇逐級(jí)脫水(乙醇濃度從30% ～100%);醋酸異戊酯置換,4℃過夜;日立HCP-2臨界點(diǎn)二氧化碳干燥儀干燥;粘臺(tái)(每種樣品分別有俯視觀察面和側(cè)視觀察面?zhèn)€一個(gè)樣品);噴金(離子濺射儀 日立 IB-5);日立S-570掃描電鏡觀察拍照。

2 試驗(yàn)結(jié)果

掃描電鏡觀察到的結(jié)果如下(參見圖1～8)。

圖1 感染后5 d對(duì)照組氣管表面纖毛排列整齊,見杯狀細(xì)胞 SEM,2 900×

圖1為感染后第5天對(duì)照組雛雞氣管掃描電鏡圖,從圖中可見,雛雞氣管表面纖毛排列整齊,似麥浪樣,還可見杯狀細(xì)胞,細(xì)胞間聯(lián)系致密。圖2為感染后第5天試驗(yàn)組雛雞氣管掃描電鏡圖,從圖中可見,感染組雛雞氣管表面纖毛集結(jié)成束,表面有大量黏液附著,纖毛擺動(dòng)無力,杯狀細(xì)胞已不易觀察到。

圖3為感染后第7天對(duì)照組雛雞氣管掃描電鏡圖,從圖中可見,氣管表面纖毛排列整齊,似麥浪樣,杯狀細(xì)胞清晰可見,細(xì)胞間聯(lián)系致密。圖4為感染后第7天氣管掃描電鏡圖,從圖中可見,氣管表面纖毛已完全被黏液覆蓋,纖毛粘連,看不見杯狀細(xì)胞。

圖2 感染后5天試驗(yàn)組氣管表面有黏液附著,纖毛粘集 SEM,2 500×

圖3 感染后7 d對(duì)照組氣管表面纖毛排列整齊,杯狀細(xì)胞清晰可見 SEM,2 150×

另外,感染后氣管還出現(xiàn)黏膜脫落,固有層裸露,氣管表面可見大量炎性細(xì)胞滲出,還可見紅細(xì)胞的穿出,隨感染期的延長(zhǎng),這些癥狀有加劇趨勢(shì)(圖5～8)。

圖4 感染后7 d試驗(yàn)組氣管表面大量黏液覆蓋 SEM,2 000×

圖5 感染后5 d,氣管表面炎性細(xì)胞滲出SEM,2 000×

圖6 感染后7 d,氣管表面炎性細(xì)胞滲出明顯增多 SEM,1 000×

圖7 感染后5 d,部分氣管黏膜脫落,炎性細(xì)胞從固有層穿出 SEM,1 000×

3 討論

氣管黏膜上皮為假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮,主要由纖毛柱狀上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞以及基細(xì)胞等構(gòu)成。

纖毛具有凈化呼吸道的重要功能,正常情況下,纖毛擺動(dòng)頻率為5～20 Hz,黏液的黏度以及心跳和呼吸頻率可影響纖毛擺動(dòng)頻率。纖毛內(nèi)、外臂中的動(dòng)力蛋白,即ATP酶提供能量,使得相鄰纖毛依次按一定順序有規(guī)律地向咽側(cè)擺動(dòng),產(chǎn)生推力,將上皮細(xì)胞表面的黏液及附著在其上的塵埃和細(xì)菌等異物推向咽部并排出[5]。

慢性支氣管炎患者的纖毛細(xì)胞內(nèi)可見線粒體腫脹和嵴斷裂;長(zhǎng)期吸煙者纖毛細(xì)胞的纖毛會(huì)減少或消失;纖毛無運(yùn)動(dòng)綜合征患者出現(xiàn)呼吸道部分纖毛細(xì)胞的結(jié)構(gòu)異常,從而導(dǎo)致纖毛運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)而不能有效地發(fā)揮其清除異物的功能。

除了形態(tài)學(xué)方法外,也可檢測(cè)氣管纖毛的運(yùn)動(dòng)來評(píng)價(jià)呼吸道黏膜屏障功能。在人醫(yī)常采用亞甲藍(lán)移動(dòng)情況觀察及氣管黏膜標(biāo)本錄像觀察的方式統(tǒng)計(jì)得到氣管黏膜纖毛的功能指標(biāo),包括黏膜纖毛清除率(MCC)、黏膜纖毛輸送率(MTR)及纖毛擺動(dòng)頻率(CBF)等,支氣管擴(kuò)張患者的氣管黏膜纖毛的功能指標(biāo)相對(duì)低下[6]。氣管離體時(shí),可采用墨水示蹤法、墨粉示蹤法與紅細(xì)胞示蹤法等示蹤法測(cè)定氣管纖毛擺動(dòng)活性數(shù)據(jù)[7]。

杯狀細(xì)胞的糖原顆粒以出胞方式排出黏蛋白,分布在纖毛頂端,與壁內(nèi)腺體的分泌物共同組成黏液層。黏液層可粘附吸入空氣中的顆粒物質(zhì),通過纖毛的定向擺動(dòng),使黏液及其所粘附的異物向咽部移動(dòng)并排出。但是病理情況下,杯狀細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)區(qū)域性增多,黏液分泌亢進(jìn),管腔內(nèi)黏液增多,同進(jìn)黏膜下層的混合腺(主要為黏液腺)也會(huì)增生肥大,黏液分泌量增多,過量的黏液會(huì)積聚潴留在管腔內(nèi),影響呼吸系統(tǒng)的正常清潔功能。

基細(xì)胞位于上皮基部,是一種未分化的干細(xì)胞,有增殖能力。在上皮損傷時(shí),可增殖分化形成其他上皮細(xì)胞。

IBV感染雛雞的組織切片可見氣管黏膜上皮的杯狀細(xì)胞明顯增多,黏液腺增生肥大,開口增多,腺體分泌亢進(jìn)。從圖2,圖4可見,感染IBV后黏液分泌明顯增多,從圖5～8可見,氣管部分纖毛及黏膜脫落,固有層裸露,同時(shí)可見有紅細(xì)胞等炎性細(xì)胞從氣管固有層細(xì)胞間穿出。這可能是由于病毒在氣管黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)大量增生繁殖,嚴(yán)重影響到纖毛上皮的功能,從而導(dǎo)致氣管等呼吸系統(tǒng)的炎癥,黏液增多,氣管黏膜上皮受損出現(xiàn)出血癥狀。同時(shí)由于纖毛柱狀細(xì)胞的受損及黏液分泌的亢進(jìn),雞只表現(xiàn)為伸頸,張口呼吸,咳嗽,并出現(xiàn)氣管啰音。剖檢死亡雞只也可見到呼吸道內(nèi)有漿液性、卡他性和干酪樣的滲出物。

以上觀察到的氣管黏膜表面的超微結(jié)構(gòu)變化表明,在IBV感染雞只后,機(jī)體防御呼吸系統(tǒng)疾病的重要門戶-氣管的結(jié)構(gòu)與功能受損,必然影響到機(jī)體對(duì)疾病的抵抗能力,這也進(jìn)一步為IB的發(fā)病機(jī)理提供了形態(tài)學(xué)上的依據(jù)。