分子生物學(xué)在蝗蟲(chóng)研究中的應(yīng)用

摘 要：本文綜述了分子生物學(xué)方法對(duì)蝗蟲(chóng)的系統(tǒng)分類、進(jìn)化關(guān)系、全基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及功能基因等方面的研究現(xiàn)狀，為蝗蟲(chóng)研究與防治提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：蝗蟲(chóng);系統(tǒng)發(fā)育;全基因組;功能基因

中圖分類號(hào)：S-33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20190630007

蝗蟲(chóng)即蝗總科昆蟲(chóng)的統(tǒng)稱，歸屬于昆蟲(chóng)綱直翅目。因其地域分布廣泛、雜食性、食量大、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)是主要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，我國(guó)有1200多種[1]，其中飛蝗能夠長(zhǎng)距離遷飛，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害最大，飛蝗又分為群居型和散居型，群居型飛蝗危害有大于散居型，兩者可發(fā)生型變。隨著生物技術(shù)以及研究方法的不斷更新和完善，對(duì)蝗蟲(chóng)的研究也逐漸從宏觀轉(zhuǎn)向微觀，尤其對(duì)2型轉(zhuǎn)變機(jī)制的研究等。

1 系統(tǒng)分類與進(jìn)化關(guān)系

利用基因克隆技術(shù)，獲得目的基因，并采用生物信息分析軟件等對(duì)多樣本目的基因進(jìn)行比對(duì)分析、構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)等以此研究相互親緣關(guān)系、進(jìn)化關(guān)系。目前，用于蝗蟲(chóng)分類構(gòu)建親緣關(guān)系、進(jìn)化關(guān)系圖譜的基因有16SrDNA、18SrDNA、CoⅠ、CoⅡ基因等[2]，因上述基因序列均具有高度保守性，序列大小適中且較易通過(guò)克隆測(cè)序獲得而被用于系統(tǒng)分類和進(jìn)化分析。其原理是根據(jù)物種間的基因高度保守區(qū)域反映物種間的親緣關(guān)系，序列的差異區(qū)域而區(qū)分種間關(guān)系。

1.1 16SrDNA、18SrDNA序列

16SrDNA是編碼核糖體RNA亞基（16SrRNA）的基因，其具有高度保守性，且廣泛存在于原核生物中，是分子分類最為常用的序列;18SrDNA是廣泛存在于真核生物編碼核糖體亞基的基因，也是分子系統(tǒng)發(fā)育常用序列，與16SrDNA一樣具有高度保守性。截至目前，F(xiàn)ilipenko KL[3]等人利用16SrDNA的部分序列對(duì)九種蝗蟲(chóng)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系構(gòu)建。印紅、張道川[4]等人獲得了錐頭蝗科、斑腿蝗科等蝗總科8個(gè)科的16SrDNA，并分析構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)及相應(yīng)的進(jìn)化關(guān)系。李新江[5]等人利用16SrDNA對(duì)6種短鼻蝗構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。印紅等獲得了18SrDNA全長(zhǎng)序列，并以此構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)一步以分子生物學(xué)手段印證了形態(tài)分類結(jié)果闡明了親緣關(guān)系。

1.2 CoⅠ、CoⅡ基因

CoⅠ、CoⅡ基因即細(xì)胞色素氧化酶亞基1亞基和2亞基，是細(xì)胞色素氧化酶的重要組成，均存在與線粒體中，與線粒體的呼吸作用起到關(guān)鍵性作用，此外，此2個(gè)基因序列均較為保守，常被用作系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究的序列。在蝗蟲(chóng)這一物種的研究中，黃原[6]等人通過(guò)CoⅠ基因序列的測(cè)定，對(duì)斑腿蝗科的7個(gè)種進(jìn)行了系統(tǒng)分類研究，其研究結(jié)果與形態(tài)分類保持一致。馬蘭[7]等人通過(guò)CoⅡ基因片段的測(cè)定分析，對(duì)22種蝗蟲(chóng)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，并對(duì)其序列進(jìn)行分析，闡明其間的相互親緣關(guān)系。肖莉莉[8]、劉艷[9]、張辰艷[10]等人分別對(duì)不同蝗蟲(chóng)物種線粒體基因組全長(zhǎng)序列進(jìn)行了測(cè)定與分析，為蝗蟲(chóng)研究提供了重要的分子基礎(chǔ)。

2 全基因組測(cè)序與DNA甲基化測(cè)序

2.1 全基因組測(cè)序

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷進(jìn)步以及測(cè)序平臺(tái)的不斷更新?lián)Q代，全基因組測(cè)序逐漸趨于成熟、成本下降，全基因組測(cè)序也逐步成為實(shí)驗(yàn)研究的重要手段。全基因組測(cè)序是指對(duì)整個(gè)生物個(gè)體且未知其基因序列利用鳥(niǎo)槍法等獲得整個(gè)生物個(gè)體基因序列。2014年，康樂(lè)[11]等人利用全基因組鳥(niǎo)槍法獲得了一個(gè)經(jīng)過(guò)8代近交的蝗蟲(chóng)雌性個(gè)體的全基因組序列，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。其研究結(jié)果表明，飛蝗基因組是目前已知?jiǎng)游锘蚪M中最大的，達(dá)到6.5Gb，共包含17307個(gè)基因，這些基因也已被其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得以驗(yàn)證，如同源基因、RNA-seq/EST等，其中通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)蝗蟲(chóng)特有基因4571個(gè)。其研究結(jié)果還提出蝗蟲(chóng)基因組中存在大量重復(fù)序列，多達(dá)2639個(gè)重復(fù)序列家族，且內(nèi)含子較長(zhǎng)于其他昆蟲(chóng)，但外顯子個(gè)數(shù)相當(dāng)。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析進(jìn)一步印證了不完全變態(tài)為多系群，且蝗蟲(chóng)（直翅目）比準(zhǔn)新翅目（蚜蟲(chóng)和體虱）更古老?；认x(chóng)的全基因組的序列成功獲得，將為蝗蟲(chóng)研究奠定分子基礎(chǔ)，也為其他昆蟲(chóng)的基因組測(cè)定提供了一定的基因注釋參考。

2.2 DNA甲基化測(cè)序

DNA甲基化即DNA堿基被甲基轉(zhuǎn)移酶催化而轉(zhuǎn)化成含有甲基的堿基，DNA甲基化通常會(huì)造成基因表達(dá)受到抑制。在早期對(duì)蝗蟲(chóng)的研究中，楊鵬程[12]等人利用RRBS即重亞硫酸鹽測(cè)序?qū)认x(chóng)全身樣品和群居、散居兩型腦部樣品進(jìn)行了甲基化測(cè)序，其結(jié)果指出，在全身樣品中均存在不同程度的甲基化，4%的甲基化出現(xiàn)在CG位點(diǎn)且主要分布于外顯子;在兩型腦部樣品中206個(gè)存在差異，此項(xiàng)研究也為日后蝗中生理、防治等提供了新的研究方向。

3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

轉(zhuǎn)錄組指在一定條件下，所研究樣本的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其包括mRNA、tRNA等，但實(shí)際實(shí)驗(yàn)研究中多為mRNA。截至目前，我國(guó)學(xué)者康樂(lè)、黃元等人先后對(duì)不同蝗蟲(chóng)物種，不同發(fā)育階段進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并對(duì)所獲得的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了分析。其中，康樂(lè)教授首次發(fā)表了飛蝗從頭轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果[13]，其結(jié)果鑒別出了105種反轉(zhuǎn)錄子，揭示了1個(gè) copia、1 個(gè)BEL、8 個(gè)gypsy 和23個(gè)非長(zhǎng)末端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄子，并且確定了可能參與蝗蟲(chóng)發(fā)育相變等相關(guān)基因，這將會(huì)為日后蝗蟲(chóng)的治理提供一定的分子基礎(chǔ)。黃元等[14]利用PacBio RS II測(cè)序平臺(tái)對(duì)中華稻蝗、中華劍角蝗和短額負(fù)蝗進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄本測(cè)序，分別獲得了全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本35995條、32817條、41125條，其中中華稻蝗共有24955條轉(zhuǎn)錄本具有開(kāi)放式閱讀框，中華劍角蝗23161條，短額負(fù)蝗28281條，并通過(guò)注釋分析獲得了大量與生長(zhǎng)發(fā)育、免疫等相關(guān)功能基因。這些大量的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)不僅為日后研究蝗中生長(zhǎng)發(fā)育等分子機(jī)制提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，也將為研制蝗蟲(chóng)防治藥物提供支持。

4 功能基因

4.1 化學(xué)感受基因

化學(xué)感受基因（Chemosensory genes，CSP）是昆蟲(chóng)在其生命過(guò)程中用來(lái)覓食、求偶、交流等系列行為極為關(guān)鍵的一類蛋白基因。飛蝗基因組中已鑒定的共有37個(gè)化學(xué)感受基因，在群居和散居蝗蟲(chóng)的研究中，有學(xué)者[15]闡述并證明了飛蝗的受氣味誘導(dǎo)機(jī)制在兩型轉(zhuǎn)變過(guò)程中至關(guān)重要。姜峰等對(duì)兩型飛蝗的CSP基因的分析表明，其在兩型發(fā)育過(guò)程中表達(dá)具有顯著地分布差異性，在蟲(chóng)卵階段，群居性表達(dá)量要低于散居型，但隨著不斷發(fā)育，其表達(dá)量逐步提升。在蝗蝻與成蟲(chóng)階段群居型飛蝗CSP基因表達(dá)量均較高，達(dá)到36%。

4.2 Hexamerin

Hexamerin為超家族蛋白，具有高度保守性。昆蟲(chóng)中的此類蛋白雖然與節(jié)肢動(dòng)物的血藍(lán)蛋白相似，但其不能像節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白那樣能夠攜氧，不能與銅離子結(jié)合，而是進(jìn)化成了一類能夠儲(chǔ)存、釋放氨基酸的功能蛋白，起到調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)吸收的作用[16]。目前，在飛蝗基因組中共鑒定了15個(gè)Hexamerin基因，明顯高于其他昆蟲(chóng)，其氨基酸組成方面，谷氨酸含量中等，丙氨酸、纈氨酸含量較高[15]。

4.3 解毒基因及害蟲(chóng)防治靶點(diǎn)

在蝗蟲(chóng)中返現(xiàn)的解讀相關(guān)基因主要有UDP-葡基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferases，UGT）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、3羧基/膽堿酯酶、ATP結(jié)合盒式蛋白和細(xì)胞色素P450超家族等[15]。其中UDP-葡基轉(zhuǎn)移酶主要參與昆蟲(chóng)對(duì)之物等有毒物質(zhì)進(jìn)行解毒的作用，在飛蝗中已鑒定出68個(gè)UDP-葡基轉(zhuǎn)移酶，這個(gè)數(shù)目明顯多于其他昆蟲(chóng)，其序列均保持一定的相似度，且具有明顯的UDP-葡基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶也具有顯著地解毒功能，其主要是通過(guò)催化谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)進(jìn)而起到解毒作用。在飛蝗中，有28個(gè)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因，且其全部存在于細(xì)胞溶質(zhì)里。羧基/膽堿酯酶是主要的殺蟲(chóng)劑及農(nóng)藥作用點(diǎn)，其主要通過(guò)控制外來(lái)有毒物質(zhì)的解毒以及神經(jīng)發(fā)育過(guò)程，在飛蝗中羧基/膽堿酯酶主要分為3類，即取食/解毒、激素/化學(xué)信息素加工和神經(jīng)/發(fā)育，目前以堅(jiān)定出個(gè)數(shù)分別為39、32、9。ATP結(jié)合盒式蛋白即ATP-binding cassette transporter，ABC蛋白家族是一類廣泛分布于各類生物中的基因，其主要功能包括底物轉(zhuǎn)運(yùn)、磺脲抑制劑和核糖體組裝因子等。在飛蝗中有65個(gè)家族成員，其在蝗蟲(chóng)中主要有殺蟲(chóng)劑耐受和代謝調(diào)節(jié)，其中ABCB和ABCC亞家族數(shù)目分別為19和9個(gè)，對(duì)外來(lái)毒物有解毒作用。大量證據(jù)表明P450基因與殺蟲(chóng)劑抗性有關(guān)，而蝗蟲(chóng)中有94個(gè)P450基因成員，數(shù)目要高于體虱和蚜蟲(chóng)，但和其他昆蟲(chóng)相當(dāng)。

5 討論

在分子水平，對(duì)蝗蟲(chóng)的研究已經(jīng)取得突破性的進(jìn)展，獲得了大量的分子數(shù)據(jù)，例如與系統(tǒng)發(fā)育研究相關(guān)的的6SrDNA、18SrDNA、CoⅠ、CoⅡ基因以及線粒體基因組全場(chǎng)序列，飛蝗的全基因組序列、大量的不同蝗蟲(chóng)/不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)等，這些數(shù)據(jù)為進(jìn)一步研究蝗蟲(chóng)的進(jìn)化、型變、適應(yīng)性等分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為日后在蝗蟲(chóng)的防治用藥的研究提供了理論依據(jù)。但如此龐大的數(shù)據(jù)，尤其飛蝗基因組數(shù)據(jù)等以及功能基因、相關(guān)分子機(jī)制都有待于進(jìn)一步挖掘、研究。

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作者簡(jiǎn)介：

楊坤（1990-），男，碩士研究生，研究方向：蝗蟲(chóng)鼠害防治工作。