毛尖茶葉中的黃酮類化合物對(duì)脂氧合酶的抑制性

吳桂玲，代虹鏡，鄧維先，羅 駿

（黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州 都勻 558000）

脂 氧 合 酶 （lipoxygenase，LOX，ECl.13.11.12），俗稱脂肪氧化酶，是廣泛存在于哺乳動(dòng)物、植物和微生物中的一類非血紅素鐵蛋白。它專門催化具有順，順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)，在植物體中脂氧合酶將亞油酸和亞麻酸轉(zhuǎn)化成氫過氧化脂肪酸[1-2]，最后由于其他酶的作用，產(chǎn)生了具有特殊風(fēng)味的酯類物質(zhì)[2]，比如說大豆的豆腥味，谷子的陳化[3]。因此，尋找高效、低毒的選擇性LOX 抑制劑已經(jīng)成為一個(gè)重要的研究方向。黃酮類化合物是一類低分子量的廣泛存在于云祥科、唇形科、豆科等天然植物中，是植物重要的次生代謝產(chǎn)物。黃酮類化合物除具有抗炎、抗突變、降壓、清熱解毒、鎮(zhèn)靜、利尿等作用外[4]，還在抗氧化方面、抗癌方面、抑制脂氧合酶方面等有顯著地效果[5-6]。因此黃酮類化合物的提取及其對(duì)脂氧合酶的抑制的研究等方面有重要意義。也可作為體外篩選天然抗腫瘤活性物質(zhì)的一種有效方法。本文對(duì)都勻毛尖茶葉中的黃酮類化合物對(duì)大豆脂氧合酶的抑制作用進(jìn)行研究。為天然抗氧化劑(黃酮類化合物)的提取及其對(duì)脂氧合酶(LOX)抑制機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)，為合理應(yīng)用黃酮類化合物對(duì)脂氧合酶的特殊作用來保鮮水果、蔬菜提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

材料：毛尖茶葉，采自都勻牛場(chǎng)；大豆，市售。

試劑：亞油酸(Sigma 生產(chǎn)，純度99.9%)；蘆丁，含量≥95.0%；Tween20；檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；硼酸緩沖液，其他化學(xué)試劑均為分析純。

儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RZ-2000Z，鄭州英峪予華儀器有限公司；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；pH-ZC 數(shù)字式酸度計(jì)，上海理達(dá)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品在溫度100℃下干燥直到蘆丁重量不再產(chǎn)生變化，用電子分析天平準(zhǔn)確稱取樣品0.0200 g，先加適量無(wú)水甲醇，使蘆丁完全溶解，再加無(wú)水乙醇，定容到100 mL，得到的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL。

分別精密吸取五組不同體積的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于5 個(gè)25 mL 的容量瓶中，用30%乙醇溶液補(bǔ)充至12.5 mL，加入1 mL 5%的NaNO2搖勻放置5 min 后，加入1 mL5%的Al(NO3)3放置5min 后，再加入10 mL 4%的NaOH 搖勻，用30%乙醇稀釋至刻度，10 min 后用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)510 nm 處進(jìn)行測(cè)定，以溶劑做空白參比。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curves of rutin

用最小二程法進(jìn)行線性回歸得蘆丁溶液質(zhì)量濃度C(mg/mL)與吸光度值A(chǔ) 關(guān)系曲線的回歸方程式為Y=10.87412C+0.0086，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。

1.2.2 黃酮類化合物的提取

將毛尖茶葉洗凈放入烘箱中在70℃的條件下烘干，用中草藥粉碎機(jī)粉碎，過20 目的分子篩（粉碎得越細(xì)越好）。稱取20 g 的茶葉粉末于500 mL 的圓底燒瓶中，按固液比為1∶20（g/mL）準(zhǔn)確量取400 mL 石油醚與茶葉粉末混勻浸泡一段時(shí)間，將浸泡好的茶葉回流，趁熱將回流好的茶葉抽濾，將濾渣用400 mL 石油醚再浸泡回流，取濾渣用400 mL 的無(wú)水乙醇回流，將濾液在50℃的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加入無(wú)水乙醇使黃酮類化合物完全溶解。將其分別用500 mL、250 mL的容量瓶定容為750 mL。

1.2.3 黃酮類化合物含量的測(cè)定

取1 mL 黃酮類化合物溶液置于25 mL 的容量瓶中，向容量瓶中加入10 mL 無(wú)水乙醇搖勻后，用30%乙醇溶液補(bǔ)充至12.5 mL，加入1 mL5%的NaNO2搖勻放置5 min 后，加入1 mL5%的Al(NO3)3放置5 min 后，再加入10 mL4%的NaOH 混勻，用30%的乙醇稀釋至刻度，10 min后用紫外可見光分光光度計(jì)在波長(zhǎng)510 nm 處進(jìn)行測(cè)定，以溶劑做空白參比。

1.2.4 大豆中脂氧合酶（LOX）的提取[7]

將大豆用蒸餾水洗凈，在低溫下（0~10)℃的條件下將大豆磨碎后再經(jīng)石油醚多次浸提后得到脫脂大豆粉。稱取24.3 g 脫脂大豆粉為原料，料液比為1∶10（g/mL），加入去離子水并用1 mol/L 的鹽酸調(diào)pH 值至4.5，攪拌50 min，抽濾；向?yàn)V液中加入固體硫酸銨至40%飽和，將濾液用2000 r/min 的離心機(jī)低溫（4℃左右）離心20 min；取上清液并向其中加入（NH4）2SO4使溶液的飽和度達(dá)到60%。再次離心20 min，將沉淀用pH9.0 的0.2 mol/L 的硼酸鹽緩沖液溶解，溶液即為大豆的粗酶液，放入冰箱冷藏備用。

1.2.5 大豆中脂氧合酶（LOX）的活性測(cè)定

底物的制備：先配制10 mL 硼酸鹽緩沖溶液，使其pH 值為9.0，濃度為0.2 mol/L，然后取Tween20 0.25 mL 分散在該緩沖溶液中，邊搖動(dòng)溶液邊滴加亞油酸0.27 mL，充分搖勻，使它們混合均勻，再加入一定體積的濃度為1 mol/L 的NaOH 溶液，邊加邊搖動(dòng)，直到使整個(gè)溶液澄清，將溶液pH 值調(diào)到9.0，然后用上述硼酸鹽緩沖液稀釋定容到500 mL 作為底物備用。

取一只潔凈干燥的試管分別向試管中5.5 mL的pH 值9.0 的硼酸鹽緩沖液，100 μL 的底物，0.4 mL 酶液（已稀釋一定倍數(shù)），搖勻后立即將試管至于60℃(在該溫度下酶的活力和黃酮類化合物的抑制效果均比較明顯) 的水浴中恒溫2 min 時(shí)測(cè)反應(yīng)液在234 nm 處吸光度。以溶劑做空白參比。重復(fù)做兩次平行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)公式X=1000×(A1-A0)/3（X:酶的活性；A1：5min 時(shí)測(cè)定的吸光度；A0：2min 時(shí)測(cè)定的吸光度；3：第二次測(cè)定時(shí)間-第一次測(cè)定的時(shí)間）計(jì)算酶的活性。

1.2.6 黃酮類化合物對(duì)大豆脂氧合酶的抑制率的測(cè)定

分別取體積為4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL 的黃酮類化合物于5 只潔凈干燥的試管中，將5 只試管分別重復(fù)1.2.5 的步驟測(cè)出反應(yīng)液在234 nm 出的活性（將其中的緩沖液換為pH 值為9.0 的硼酸緩沖液）。按照抑制率計(jì)算公式：Y=(B0-B1)/B0×100%計(jì)算其抑制率。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 黃酮類化合物的提取

實(shí)驗(yàn)測(cè)得得黃酮類化合物在510 nm 處的吸光度為0.641，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Y=10.87412C+0.0086，計(jì)算得都勻毛尖茶中黃酮類化合物的提取率為5.227%。

2.2 大豆中脂氧合酶的活性測(cè)定及黃酮類化合物對(duì)其的抑制率

實(shí)驗(yàn)測(cè)得大豆脂氧合酶在60℃時(shí)酶的活力為37.165。根據(jù)公式Y(jié)=(B0-B1)/B0×100%分別計(jì)算得不同濃度的黃酮類化合物對(duì)大豆脂氧合酶的抑制率數(shù)據(jù)見圖2。黃酮類化合物對(duì)大豆脂氧合酶的抑制率隨其濃度的增加而增強(qiáng)。

圖2 黃酮類化合物對(duì)大豆脂氧合酶的抑制率Fig 2 The inhibition rate for soybean lipoxygenase of flavonoids

通過我們之前的研究，發(fā)現(xiàn)密蒙花中的黃酮類化合物對(duì)大豆脂氧合酶有一定的抑制作用[5]，已有研究發(fā)現(xiàn)矢車菊素、矮牽牛素和飛燕草素可能對(duì)黑豆LOX 有一定的抑制性[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毛尖茶葉總黃酮對(duì)大豆中的LOX 的也有一定的抑制作用。

3 結(jié)論

都勻牛場(chǎng)的毛尖茶葉中的黃酮類化合物的提取率為5.227%。黃酮類化合物對(duì)大豆脂氧合酶有一定的抑制作用，隨著黃酮類化合物濃度的增加，對(duì)脂氧合酶的抑制作用也隨之增強(qiáng)。通過此研究，可為尋找天然的LOX 抑制劑奠定了一定的理論基礎(chǔ)。