脅迫條件下極端微生物修復石油烴污染土壤研究進展

桑義敏，艾賢軍，王曙光，朱玲，梁存珍，劉婧，孔欣然

1. 北京石油化工學院環(huán)境工程系，北京 102617；2. 北京化工大學環(huán)境科學與工程系，北京 100029

石油是世界上最普遍的土壤污染物之一，主要由有機和無機化合物組成，其主成分為碳氫化合物，約占其總成分的98%，石油成分的變化取決于油源儲層中的硫、氮、氧和金屬化合物等物質的不同組合（Gomes et al.，2018）。現(xiàn)代經濟對石油的依賴程度較高，在原油開采、運輸及再加工過程中存在較大的環(huán)境污染風險，據(jù)不完全統(tǒng)計，全球每年原油泄漏量在二十萬噸至兩百萬噸之間（Fatima et al.，2016）。原油通過氧氣脅迫和直接毒性作用等，對數(shù)量巨大的動、植物和微生物的生存情況構成了極大威脅。通常用于石油污染修復的技術主要有阻隔填埋、熱脫附、土壤洗脫等技術，這些傳統(tǒng)的石油烴污染修復技術處理效率較低、能耗較大且對環(huán)境有隱藏的風險性（Mandri，2007）。近年來生物修復受到了特別的關注，其中微生物修復石油污染土壤是一種環(huán)境安全、成本效益高的技術（Kumar et al.，2011）。然而，實際的石油污染土壤場地，往往存在于低溫、鹽堿等極端環(huán)境中，或是重金屬-石油烴復合污染，或是重質石油組分（瀝青質和樹脂）占比過高，常規(guī)石油烴類降解微生物難以生存，大大增加了微生物修復的難度和挑戰(zhàn)。耐冷菌、嗜冷菌、嗜鹽菌、耐重金屬菌、耐重質原油菌等極端微生物廣泛存在于極地高寒、鹽堿地以及有重金屬、重質原油毒性存在的復合污染土壤環(huán)境中。這些微生物可以在極端條件下生長繁殖，形成一套與環(huán)境相適應的獨特的分子機制和石油烴降解特征，對特殊環(huán)境中的污染物有良好的處理效果。在利用極端微生物修復極端、脅迫條件下的石油污染土壤方面，菌種性能尚不能滿足需要，有些規(guī)律尚存在爭議，有些機理機制還不明晰，推廣應用尚存在一些障礙。本文將從低溫、鹽堿、重金屬、重油等脅迫角度，按照“適應機制→降解機理→降解特性→修復實踐”的思路，進行文獻綜述和總結分析，以期為脅迫條件下極端微生物修復石油烴污染土壤提供一定的借鑒和參考。

1 低溫脅迫條件下石油烴污染土壤的微生物修復

全球不少于80%的生物圈為常年低于5 ℃的永久低溫地區(qū)。與溫熱帶環(huán)境相比，原油污染在寒冷氣候條件下（包括極地和亞極地）對于環(huán)境的影響可能更加嚴重。寒冷氣候的季節(jié)性、偏遠性和低修復效率使寒冷地區(qū)的風險管理和修復成本大大增加（Princz et al.，2012）。微生物修復（利用微生物降解或解毒污染物）被認為是一種對寒冷地區(qū)破壞性較低的修復技術，因為在受碳氫化合物污染的寒冷氣候土壤中，通?？梢园l(fā)現(xiàn)適應寒冷環(huán)境的碳氫化合物降解細菌。20世紀80年代Trevors（1982）從土壤、淡水和海洋系統(tǒng)中分離出的低溫微生物，能廣譜利用自然環(huán)境中存在的各種石油烴，并將其作為唯一的能源和碳源。中國北方地區(qū)有漫長的冬季，利用耐冷微生物對寒冷地區(qū)石油污染土壤進行生物修復、研究其冷適機制和降解特征，具有切實可行的實際意義。目前針對寒冷地區(qū)的烴類污染生物修復技術主要利用夏季非凍結時期，但是該時段往往不能貫穿整個修復周期（Chang et al.，2014）。

嗜冷菌必須生活在低溫條件下且其最高生長溫度不超過20 ℃，最適生長溫度為5 ℃，在0 ℃可生長繁殖；耐冷菌最高生長溫度高于 20 ℃，最適溫度高于 15 ℃，在 0-5 ℃可生長繁殖（Margesin et al.，2001）。耐冷菌和嗜冷菌等低溫細菌廣泛分布于冰、雪、水、巖石及土壤等低溫環(huán)境中，主要包括真細菌、藍細菌、酵母菌、真菌、放線菌及藻類，其中以細菌居多（Buzzini et al.，2012）。徐成斌等（2014）通過對撫順石油二廠曝氣池活性污泥的馴化和分離，得到一株以柴油為碳源的低溫降解菌株 Q21（假單胞菌屬），經鑒定為瓊式不動桿菌。黃磊等（2007）從渤海油船泄漏區(qū)域的海底泥中篩選到1株能降解柴油的低溫菌T7-2（紅球菌屬），初步鑒定為紅平紅球菌。

1.1 嗜低溫微生物的冷適機制

低溫微生物長期生活在低溫環(huán)境中，通過進化形成了一系列的適冷機制，保證其在低溫條件下的正常生命活動（Antony et al.，2012）。為適應環(huán)境溫度的變化，微生物必須調節(jié)細胞膜脂類組成，以調節(jié)細胞膜的流動性。生長溫度的降低有助于短鏈形成、脂肪酸甲基分支增加、支鏈脂肪酸比例增加、環(huán)狀脂肪酸比例減少（Chattopadhyay，2006；D'Amico et al.，2006）以及冷激蛋白、冷適應蛋白和DEAD-box RNA解旋酶的合成，以保持低溫下RNA的正確折疊、蛋白質翻譯等重要的生命活動。防止細胞溶質凍結的適應性也很重要，許多嗜冷菌產生的防凍蛋白抑制冰晶晶格的形成（Modig et al.，2010），而其他嗜冷菌則濃縮糖以降低細胞溶質冰點（Holmstrup et al.，2002）。此外，冷激蛋白似乎是低溫適應的重要組成部分（D'Amico et al.，2006）。耐冷菌通過膜蛋白的磷酸化、去磷酸化等復雜代謝過程來快速感受溫度變化，通過信號傳導的方式輔助完成一系列適冷反應（Ray et al.，1994）；其細胞膜中具有流動性的β-胡蘿卜素，也能促進其對極端低溫的適應性（Wang et al.，2014）。除了這些適應性機制，維持足夠的代謝通量對于生化過程也非常重要。

為了解決代謝通量的問題，嗜冷酶往往表現(xiàn)出氨基酸特異性的取代，這些微小的取代仍能維持結構完整性，但足以增加靈活性和催化效率（Siddiqui et al.，2006）；因此，嗜冷酶能夠維持代謝功能。嗜冷微生物的嗜冷酶具有較少的脯氨酸和精氨酸，較低的脯氨酸與賴氨酸，比較少的二硫鍵（Georlette et al.，2003），有助于提高能量產生和儲存效率等以適應低溫環(huán)境（辛玉華等，2013）。與中溫細菌相比，嗜冷菌的γ-proteobacteria編碼AMP合成酶的基因拷貝數(shù)增加，而編碼AMP降解酶的基因拷貝數(shù)降低，這是微生物向冷適應進化的必不可少的一個步驟（Parry et al.，2011）。為適應冷環(huán)境，微生物內部的生化變化還包括分子內相互作用的減少以及極性/非極性殘基（residue）在體積、位置和大小等方面的改變（Farrell et al.，2004），這些變化通常犧牲了熱穩(wěn)定性而保持細胞在低溫下的靈活性（Siddiqui et al.，2006）。

嗜冷菌對低溫的另一種適應與能量代謝有關。隨著溫度降低，嗜冷菌細胞內三磷酸-5′-腺苷（ATP）水平呈升高傾向，即使生長速率與溫度直接相關。鑒于熱能降低、吉布斯自由能降低和水的粘度增加，溫度條件一般會導致擴散速率降低。ATP濃度的增加可預測地減少到依賴酶的平均擴散距離，消除與溫度有關的吉布斯自由能減少，從而推動生化反應（Amato et al.，2009）。

Parry et al.（2011）揭示了5′-腺苷一磷酸（AMP）的合成（帶下劃線的；深色箭頭）基因與分解（粗體；虛線箭頭）基因和相關生化過程（灰色文本和箭頭），如圖 1所示，箭頭表示穩(wěn)態(tài)條件下的有利反應方向?；蛎Q與酶一一對應：ushA，5′-核苷酸酶；gsk，肌苷激酶；ampD，AMP脫氨酶；purA，腺苷酸肉桂酸合成酶；purB，腺苷酸基琥珀酸；adk，腺苷酸激酶；apt，腺嘌呤磷酸核糖轉移酶；amn，AMP核苷酶；pykF，丙酮酸激酶；atp N，ATP合成酶。嗜冷菌的嘌呤代謝途徑與 5′-腺苷-單磷酸（AMP）合成酶有關，而嗜溫菌的嘌呤代謝途徑與AMP降解酶有關。

圖1 5′-腺苷一磷酸（AMP）的合成基因與分解基因和相關生化過程Fig. 1 Schematic diagram of major AMP synthetic (underlined； dark arrows) and AMP degradative(bold； dashed arrows) genes and relevant biochemical pathways (gray text and arrows).

1.2 嗜低溫微生物的石油烴降解機理

1.2.1 常溫條件下的石油烴降解機理

石油烴在好氧條件下降解最快、最徹底。圖2a顯示了烴類好氧降解的主要機理。烴類污染物的初始胞內攻擊是一個氧化過程，氧的活化和摻入是氧合酶和過氧化物酶催化的酶促關鍵反應。外圍降解途徑將烴類污染物逐步轉化為中間代謝[如三羧酸(TCA)循環(huán)]的中間產物，如乙酰輔酶A、琥珀酸鹽、丙酮酸鹽。這些代謝產物與無機鹽類一起，作為細胞合成、生物量增長的前驅物。石油烴類的降解過程由特定的酶系統(tǒng)來調節(jié)、主導。圖 2b顯示了氧合酶對烴類等外源性物質的初始攻擊過程。其他相關機制還有微生物細胞與基質（油滴）的附著機理以及生物表面活性劑的產生機制，前者尚不清楚，后者已經得到了很好的研究（Das et al.，2011）。

圖2 微生物好氧降解石油烴的主要原理（a）及酶反應（b）Fig. 2 Main principle (a) and enzymatic reactions (b) of petroleum hydrocarbons aerobicly degradated by microorganisms

1.2.2 低溫條件下的石油烴降解機理

石油烴低溫降解菌的基因和酶對降解機理有重要影響。嗜冷酶在低溫下具有高活性的分子機制，北極嗜冷菌Shewanella sp. AS-11的乙酸激酶（SAK）比中溫菌E. coli K-12的乙酸激酶（EAK）更具柔韌性但更不穩(wěn)定，低溫下催化活力更高（Tang et al.，2012）。王世杰等（2011）認為低溫微生物降解石油烴的功能基因主要存在于辛烷質粒（OCT質粒）、甲苯-二甲苯質粒（TOL質粒）、萘質粒（NAH質粒）和控制甲苯、對位或間位二甲苯的XYL質粒等線粒體或質粒上。而 Margesin et al.（2003）則認為低溫石油烴降解菌的降解性能與其基因類型和生物活性或是其數(shù)量無相關性，與污染水平之間也沒有相關性。此外，George et al.（2002）研究了 18種不同種油類的降解特性，結果表明與生物降解有關的動力學同位素效應是特定于某個位點的，且通常與某一位點的終端碳原子有關，它對同位素組成的影響隨著碳原子數(shù)的增加而逐漸降低。

1.3 嗜低溫微生物對不同組分石油烴的降解特性

低溫環(huán)境中物質的粘性升高、溶解性降低，從而影響其生物可降解性（Foght et al.，1996）。石油是多種烴類組成的混合物，包括烷烴、環(huán)烷烴和芳烴等，其中以直鏈的烴類最易被氧化，芳烴和環(huán)烷烴的氧化較難。烴類降解菌分解輕質原油的能力高于分解重質原油（Atlas，1975），而原油的化學成分又能影響細菌的種類組成（Balks et al.，2002）。北極耐冷石油降解菌BJ1、BJ9和BJ19（假交替單胞菌屬）可降解多環(huán)芳烴中萘、芴、二苯并噻吩、菲和屈等多種組分，對碳源的利用具有廣譜性（那廣水等，2010）；BJ1、BJ9、BJ19和混合菌群對汽油和海燃油降解效果明顯，而對原油和燃料油等降解效果較差。徐成斌等（2014）馴化和分離得到的低溫降解菌株 Q21（假單胞菌屬），其降解柴油的最適接種量是 10%，最適溫度是 15 ℃，最佳 pH值為7.0，最適搖床轉速為150 r·min-1，最佳鹽度為0.5%-1.0%；能降解柴油中所含的 C9-C24之間大部分烷烴。黃磊等（2007）篩選的低溫石油烴降解菌 T7-2（紅球菌屬），接種人工海水烴降解培養(yǎng)基后，通過補加氮源(NH4)2SO42.64 g·L-1、磷源Na2HPO42.5 g·L-1和酵母粉 0.015 g·L-1后，15 ℃振蕩培養(yǎng)7 d，對烷烴的降解范圍很廣泛，C12-C36均有不同程度的降解，總降解率可以達到73.2%。Wang et al.（2014）篩選的NJ 41菌（動性球菌屬）和NJ49菌（希瓦氏菌屬），能在極端低溫的南極環(huán)境下，將石油烴類物質由長鏈直鏈烴分解為短鏈直鏈烴。

1.4 低溫脅迫條件下生物強化/刺激修復石油烴污染土壤

通過人為地向土壤中加入優(yōu)勢低溫降解菌，可以極大地提高石油烴類污染物的降解效率。Mohn et al.（2001）通過現(xiàn)場土壤修復試驗證實，添加耐冷混合菌刺激，極地寒冷地區(qū)土壤中超過80%的石油烴被降解。Ruberto et al.（2005）從南極污染土壤中分離出3株紅球菌菌株并進行應用試驗，其在低溫環(huán)境中對石油烴類污染物的降解效果顯著。

除了生物強化，向土壤中投加營養(yǎng)物質、最終電子受體以及表面活性劑等物質，以刺激微生物的生長，增加微生物生物量，從而提高石油烴降解率。（1）投加營養(yǎng)物質。向低溫石油污染土壤中施入降解菌-堆肥制劑，可提高土壤中的石油烴去除率（吳蔓莉等，2017）；向低溫石油污染土壤中添加水和營養(yǎng)物質，也可刺激微生物、提高石油降解率（Stallwood et al.，2005）。（2）添加最終電子受體。添加 O2、NO3-、SO42-、Fe3+最終電子受體是寒冷地區(qū)微生物降解石油烴的重要操作方式。Jeong et al.（2015）通過向土壤噴灑含有嗜冷石油烴類降解菌和營養(yǎng)物質的表面活性劑泡沫，達到保溫、加濕以及供氧作用，促使總石油烴去除率由46.3%提高至73.7%，一級反應動力學常數(shù)由0.019 d-1提高至0.044 d-1。（3）添加表面活性劑。向污染土壤添加表面活性劑可以降低油類表面張力，提高水溶性，使微生物可以更充分地接觸石油污染物從而提高了降解效率（Kang et al.，2010）。Pepi et al.（2005）從南極分離出的ANT-3b菌（鹽單胞菌屬），在2%正十六烷培養(yǎng)基中常規(guī)生長時，可產生乳化糖脂表面活性劑，改善了石油烴類物質的可利用性，從而提高了降解效率。

2 鹽堿脅迫條件下石油烴污染土壤的微生物修復

中國北方地區(qū)的油田土壤含鹽量普遍較高，其中，中原油田污染土壤含鹽量為7.07 g·kg-1（劉文霞等，2002）；遼河油田土壤含鹽度可達9.0 g·kg-1以上（潘文利等，1998）；勝利油田所處的黃河三角洲鹽漬化土壤含鹽度達15.0 g·kg-1（劉其友等，2011）；大慶油田和吉林油田所在的松嫩平原是中國典型的內陸鹽堿濕地集中分布區(qū)，大慶地區(qū)的土壤基本都呈堿性，很多地區(qū)含鹽量在8 g·kg-1以上（姜明等，2005）。高鹽脅迫條件制約了石油烴降解菌的生長及其對石油烴污染土壤的修復能力，限制了高鹽堿石油污染土壤生物修復技術的應用（Liu et al.，2011）。

根據(jù)耐鹽性能的不同，嗜鹽菌分為非嗜鹽菌、輕度嗜鹽菌、中度嗜鹽菌和極端嗜鹽菌共 4類（Chengbin et al.，2012）。中國西部具有十分豐富的嗜鹽菌資源，主要分布在新疆鹽湖亞區(qū)、青海鹽湖亞區(qū)、西藏鹽湖亞區(qū)和陜、甘、寧、蒙鹽湖亞區(qū)、鹽堿地等（李明慧等，2002）。從各類石油污染鹽堿地中分離、篩選嗜鹽堿微生物，是進行機理分析的重要前提。Wang et al.（2010）從中國勝利油田受原油污染的鹽漬土壤中分離出兩種可將原油作為唯一碳源的新型放線菌DQS3-9A1T和DQS3-9A2（分支桿菌屬），可在土壤含鹽量為1%-12%（w/v）范圍內生長。Zhao et al.（2012）從原油污染的鹽堿土壤中分離出一株A-1T菌株（鹽單胞菌屬），其屬于中度嗜鹽菌，在含鹽量0.05%-27.5%（w/v）（最佳5%-8%）條件下存活。Wu et al.（2009）發(fā)現(xiàn)一株屬于絲狀菌屬分支的新型耐鹽菌菌株SLG5B-19T，在NaCl濃度在0-7%（w/v）范圍內生長良好。Wu et al.（2012）分離出一株較高表面活性和耐鹽性的鹽堿地高效石油降解菌 BF40（沙雷氏菌屬），其土壤原油去除率為0.22%-1.20%。付瑞敏等（2016）通過注入低能N+誘變野生株YJ8（沙雷氏菌屬）并獲得突變株YJ8-10（沙雷氏菌屬），在NaCl濃度為80 g·L-1的高鹽濃度中仍生長良好。Wang et al.（2007）從原油污染的鹽漬土中分離出兩株中度嗜鹽菌株 SL014B-69T和 SL014B-62A2（兩株菌均屬鹽單胞菌屬），可適應的 NaCl濃度為1%-20%（w/v），溫度為10-42 ℃，pH為8.0-9.0。Gomes et al.（2018）從含油樣品中分離出141種嗜鹽菌菌株，研究發(fā)現(xiàn)該類菌株具有較高的分類學和遺傳多樣性，具有進一步應用于生產生物表面活性劑或生物修復技術的突出潛力。

2.1 嗜鹽堿微生物的適鹽堿機制

嗜鹽菌對高鹽環(huán)境的適應機制體現(xiàn)在以下幾個方面：（1）嗜鹽菌調節(jié)滲透壓平衡方式：一是在細胞內積累高濃度的K+抵抗胞外的高滲環(huán)境；二是在細胞內積累或產生相容性介質以適應高鹽環(huán)境（曹軍衛(wèi)等，2004）；（2）嗜鹽菌對高濃度 Na+的依賴性：嗜鹽菌細胞壁糖蛋白中的酸性氨基酸的羧基需要 Na+來穩(wěn)定，故高 Na+濃度可以維持細胞壁結構完整，同時保證細胞功能正常（王偉偉等，2015）；（3）大多數(shù)嗜鹽菌能迅速合成和降解糖、氨基酸等小分子溶質，構成滲透壓調節(jié)劑，幫助細胞從高鹽環(huán)境中獲取水分，并且穩(wěn)定和保護菌體內酶的活性；（4）嗜鹽菌的細胞蛋白還可特異地結合許多低分子量的親水性氨基，使細胞質呈現(xiàn)溶液狀態(tài)，以便在高鹽環(huán)境中發(fā)揮其功能（Oren，2002）；（5）嗜鹽菌可通過細胞膜上的轉運系統(tǒng)從周圍環(huán)境中吸收相容性溶質以節(jié)省從頭合成所需的能量（Pflüger et al.，2004）。JNPH-3（Halorubrum 屬）菌株專一性依賴高濃度的Na+，對Cl-依賴性較弱，K+濃度變化對菌體生長無顯著影響，其菌體通過自身產生四氫嘧啶的機制來調節(jié)滲透壓（張曉梅等，2010）；NY-001（鹽單胞菌屬）中度嗜鹽菌可以從環(huán)境中吸收相容性溶質以對抗高鹽環(huán)境，其潛在的轉運體系與相容性溶質合成體系共同構成了以相容性溶質為媒介的抗鹽系統(tǒng)（王魁榮等，2010）。

嗜鹽堿微生物中存在著細胞外被（cell coat）（圖3a）和離子反向運輸機制（圖 3b），其中前者可將細胞外堿性環(huán)境與細胞內的中性環(huán)境隔離，后者則在生長和發(fā)育過程中維持較為穩(wěn)定的胞內鈉離子濃度（Mirete et al.，2016）。

圖3 耐鹽堿微生物的細胞外被（cell coat）及離子正常/反向運輸機制Fig. 3 Sketch of the cell coat (a) and difference between normal transport and antiport (b)

2.2 嗜鹽堿微生物的石油烴降解機理

土壤鹽分和石油碳氫化合物（TPH）濃度是影響土壤細菌多樣性和群落結構的兩個主要環(huán)境因子。鹽分含量與土壤微生物生物量碳（MBC）及微生物生物量氮（MBN）具有負相關關系，但對細菌香農均勻度指數(shù)的影響較小。TPH濃度與土壤MBC呈負相關，與MBN和香農指數(shù)呈正相關，但對均勻度指數(shù)無影響。盡管隨著鹽堿化程度的增加，某些物種的多樣性得到加強，但是土壤鹽分對大多數(shù)種群具有抑制作用，而土壤TPH對群落多樣性具有選擇性影響。放線菌、g-變形菌、厚壁菌、熱球菌及其他一些未知菌種是鹽堿化和油污雙重脅迫下的優(yōu)勢菌（Gao et al.，2014）。

Ebadi et al.（2017）研究表明，含鹽土壤會降低石油烴微生物降解的速率和程度；但是，在添加氮肥、磷肥以及產生生物表面活性劑/耐鹽菌種的條件下，能明顯增強石油烴微生物降解的速率和程度（見圖4）。

圖4 鹽堿土壤環(huán)境中的烴類微生物降解機理Fig. 4 Main principle of petroleum hydrocarbons aerobicly degradated by microorganisms in saline contaminated soil

2.3 嗜鹽堿微生物對不同組分石油烴的降解特性

首先，不同種類嗜鹽堿微生物對石油烴的總體降解效率有所區(qū)別。謝鯤鵬等（2009）分離到的屬于假單胞菌屬的耐鹽原油降解菌LSD-3，在原油濃度為 0.5 g·L-1、NaCl濃度為 30 g·L-1、pH 值為 8、溫度為30℃、接種量為3%等最適條件下，經過5 d的培養(yǎng)，原油的降解率為68%。

其次，不同種類嗜鹽堿微生物對不同組分石油烴的降解特征也不同。胡春輝等（2017）在遼河口濕地油田石油污染土壤中分離到一株耐鹽柴油高效降解菌株L7（不動桿菌屬），經鑒定其為不動桿菌，在最適條件下培養(yǎng) 5 d后的柴油降解效率為61.5%，菌株L7具有高效降解中長鏈烷烴的能力，對碳鏈長度在 19-25的飽和烷烴降解效率接近100%。Liu et al.（2019）通過22周的柱模擬，正構烷烴（C8-C40）和 16PAH的降解率分別達到42.45%和34.61%。短碳鏈烷烴（C8-C12）主要被土壤表層（0-30 cm）微生物降解，只有少數(shù)部分遷移到深層（30-60 cm）土壤中。長鏈烷烴天生不易降解或遷移到深層土壤中。含有3個以上芳香環(huán)的多環(huán)芳烴很難被降解。好氧菌、假單胞菌、濱海桿菌是表層土壤中主要的石油降解菌，而類桿菌、乳球菌、嗜堿菌等厭氧菌在深層土壤中起著至關重要的作用，鐮刀菌和曲霉是0-60 cm深土壤中主要的石油降解菌。通過對實驗室柱模擬的研究，環(huán)境變量對微生物對石油污染的響應有著深刻的影響，特別是鹽度、粘土含量和厭氧條件分別影響0-30、30-60和60-80 cm深土壤微生物群落組成的主要因素。

最后，溫度、鹽度等條件也會影響嗜鹽堿微生物對石油烴的降解特性。Anderson（2013）的研究表明沙漠土壤溫度和鹽度的波動將直接影響其中微生物的活性和多樣性，從而影響生物修復的效率。Minaitehrani et al.（2009）研究表明，NaCl含量對微生物降解重質原油污染土壤的效果有較大影響，隨著 NaCl含量增多，微生物對石油污染土壤的分解作用逐漸降低。

2.4 鹽堿脅迫條件下生物強化/刺激修復石油烴污染土壤

將篩選培育出的優(yōu)勢耐鹽石油降解菌，應用于生物強化土壤修復實踐中，并進行降解性能及降解條件優(yōu)化等方面的研究探索，是目前科技工作者的一項重要工作。Dastgheib et al.（2011）分離出一株耐鹽菌株 Qtet3（食烷菌屬），可以在用 2.5%濃度NaCl溶液灌溉的石油污染土壤中生長和存活，且其石油烴類降解率可達 26.1%。劉其友等（2011）在石油污染土壤中投加復合菌株CM-13（復合菌株，無屬名），當其接種量為土壤質量的 10%時，修復效果較好，對石油污染物質的加速降解作用顯著。此外，微生物的生長與營養(yǎng)鹽的量存在最佳匹配值，土壤中氮的最佳含量為0.20%，磷的最佳含量為0.05%，石油類的降解率隨著麥糠投加量的增大而逐漸增大，當麥糠量為土壤體積分數(shù)的25%時，對土壤的修復效果最好。

Ebadi et al.（2017）將數(shù)種產生生物表面活性劑的銅綠假單胞菌菌株組合形成菌群，可以減輕鹽度對生物降解的不利影響，經菌群處理過的土壤對植物產生的毒性降低了30%。從含油樣品中分離出的嗜鹽菌菌株具有在生物表面產生活性劑或生物修復的潛力（Zhao et al.，2009）。利用鹵代菌群落進行植物和微生物增強重質原油污染鹽漬土的修復也很有效（Cai et al.，2016）。郭若勤等（2009）在含油量高達19.51 g·kg-1（干土）、含鹽量高達8.26 g·kg-1（干土）的土壤中，投加嗜鹽菌和馴化土著菌的修復效果比不投加嗜鹽菌的高出9.8%，表明嗜鹽菌和馴化土著菌的共同作用提高了土壤的生物修復效果。不同修復技術的耦合對原油污染鹽漬土的降解效果更佳。

3 重金屬脅迫條件下石油烴污染土壤的微生物修復

地殼中含量在1000 mg·kg-1以下的金屬被稱為微量元素，根據(jù)其密度可分為微量金屬元素和重金屬元素。重金屬污染主要源于采礦、工農業(yè)廢物、礦物燃料、采油等活動（Nouri et al.，2008）。石油勘探和開采、原油泄漏等會導致大量重金屬進入土壤環(huán)境，石油污染往往伴生重金屬污染（Essiett et al.，2010）。委內瑞拉和加拿大的原油中發(fā)現(xiàn)了釩，煉油廠和耗油熱電廠的大氣排放亞微觀顆粒中發(fā)現(xiàn)了廣泛的重金屬（Banat et al.，2006）。臺灣以石油為燃料的熱電廠的大氣排放物中存在砷、鎘、鉻、鎳和鉛等元素（Wang et al.，2010）。在石油開采的地方，土壤中含有鉻、鉛、鎘、鎳、鋅和銅等重金屬元素（Gruji? et al.，2004）。在油田石油泄漏的原生污染區(qū)，重質堿土金屬（Sr、Ba）和鑭系元素（Ce、La）的富集是其主要特征。石油中所含重金屬比例不高，但難于被生物降解，一旦進入土壤，就會長久殘留，不斷積累，對人類和其他生物造成極大危害（Agbogidi et al.，2013）。重金屬的毒性效應，會對石油烴的微生物自然降解和修復產生不利影響（Vodyanitskii et al.，2012）。

3.1 石油烴降解菌的重金屬適應機制

受到石油烴-重金屬污染的土壤，往往富集多種耐重金屬且能降解石油烴的真菌和細菌，它們可通過多種作用方式共同對抗土壤重金屬的毒害作用。這些石油烴降解菌已發(fā)展出多種金屬耐受機制，包括排除、生物吸附、主動去除、沉淀或細胞內外空間的生物累積（Rajkumar et al.，2009）。此外，酶解毒功能是另外一種金屬耐受機制，如可將二價汞生物還原成汞（Achakzai et al.，2012）。從細胞結構的角度，整個解毒機制分三類：（1）細胞外部沉淀機制，通過分泌胞外物質改變環(huán)境條件等使重金屬發(fā)生沉淀作用；（2）細胞表面吸附機制，通過各種作用將重金屬離子吸附固定在細胞表面，減少細胞內部的吸收，涉及到絡合、配位、離子交換、無機微沉淀、氧化還原及靜電吸附等多種吸附機制；（3）細胞內部解毒機制，涉及到重金屬的運輸和解毒機制等，較為復雜。在實際應用中，各自獨立運作的幾種機制通常共同作用，從而起到更強的降解作用（Javanbakht et al.，2014）。

石油烴降解菌對重金屬的生物吸附作用可概括為3點：細胞外吸附、細胞內吸附、細胞表面吸附（Cai et al.，2008）。細胞外吸附主要利用活細胞分泌的糖蛋白和多肽或生物多聚體作為生物吸附劑，以實現(xiàn)對重金屬離子的去除作用（Volesky，2001）；細胞內吸附主要由細胞自身代謝途徑，使金屬生物沉淀或通過生物轉化使其低毒或易于回收（Vijver et al.，2004）；細胞表面吸附主要通過表面生物大分子吸收轉運、空泡吞飲等功能，以實現(xiàn)重金屬離子的去除作用（Kang et al.，2006）。

此外土壤微生物可以保護聯(lián)合修復工藝中的植物免受重金屬的有害影響，甚至增加超蓄積植物對金屬的吸收（Weyens et al.，2009）?？菇饘俑鼍≧hizobacteria）通過誘導硫醇類化合物（Courbot et al.，2004）、過氧化物歧化酶（Vallino et al.，2009）或金屬硫蛋白（Ramesh et al.，2009）等來增強寄主植物的金屬耐受性。

3.2 重金屬脅迫條件下石油烴降解菌的微生物作用機理

重金屬的不同形態(tài)具有不同的流動性、生物可利用性和潛在的環(huán)境污染性，關系到石油-重金屬復合污染土壤修復過程中微生物的降解效率以及是否需要增加輔助工程解決重金屬污染等問題，因此必須考慮重金屬有效態(tài)及形態(tài)的變化（Vodyanitskii et al.，2012）。石油污染土壤中的金屬形態(tài)、含量和分布受有機質、水分、大團聚體以及電導率等因素影響較大（Yao et al.，2016），也受季節(jié)變化的影響（Ideriah et al.，2013）。有機物對重金屬環(huán)境行為的影響十分復雜，高分子有機物通過絡合或螯合、吸附、截留等作用，鈍化土壤中重金屬；低分子有機物通過螯合、絡合作用活化土壤中重金屬。原油污染土壤中的金屬離子與土壤顆粒的結合比較松散，流動性因子較高，金屬的流動因子順序為Cd＞Zn＞Pb＞Ni＞Mn＞Cu＞Cr（Iwegbue，2011）。

石油烴-重金屬復合污染鹽堿土的微生物修復過程中，土壤中有效態(tài)Cd2+、Ni隨培養(yǎng)時間延長，有效態(tài)含量呈起伏變化，且土壤中有效態(tài) Cd2+與Ni的變化規(guī)律存在明顯差異（陳雪蘭等，2013）。培養(yǎng)60 d后，土壤Cd2+的可氧化態(tài)含量均下降，可還原態(tài)含量均略有增加，低濃度時弱酸提取態(tài)Cd2+含量降低，殘渣態(tài)Cd2+含量增加，高濃度時變化趨勢相反。培養(yǎng)60 d后，Ni的弱酸提取態(tài)、可還原態(tài)、可氧化態(tài) 3種形態(tài)總量呈下降趨勢，殘渣態(tài)Ni含量則增加，Ni的形態(tài)分布由不穩(wěn)定向穩(wěn)定方向遷移，活性降低。

石油烴-重金屬復合污染鹽堿土壤的生物修復過程中，微生物對石油烴的降解機理同于非極端條件的降解機理。微生物對重金屬的修復機制包括生物吸附、細胞內積累、酶催化轉化、生物浸出和生物礦化、氧化還原反應（Lloyd，2002）。利用微生物/植物對土壤進行解毒或去除重金屬，可改善土壤質量并恢復土壤功能（Ye et al.，2017），雖然修復時間較長但成本效益高，可用于強化自然衰減過程。（1）細菌等微生物有能力影響重金屬的遷移率和對植物的可用性，可以通過鐵載體、有機酸、生物表面活性劑、生物甲基化和氧化還原等途徑將重金屬轉化為生物可利用的或可溶的形態(tài)，促進植物對土壤結合金屬的吸收（Gong et al.，2018）。（2）細菌等微生物具有多種促生長能力，包括磷增溶、固氮、固鐵、植物激素和ACC（L-氨基環(huán)丙烷-L-羧酸）脫氨酶合成（Li et al.，2011），可改善植物生長，增加植物生物量，進而促進植物修復。例如，抗金屬根瘤菌能夠通過產生各種物質刺激植物生長和金屬積累，即單環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨基酶和鐵磷酸鹽、吲哚乙酸（IAA）（Rajkumar et al.，2012）。

3.3 重金屬脅迫條件下石油烴降解菌的微生物作用特性

土壤中金屬的濃度不會顯著地影響植物在污染土壤中對原油的去除能力（Atagana，2011）。Jiang et al.（2008）從一種重金屬污染土壤中分離出一種耐重金屬細菌株Burkholderia sp.J62（伯克氏菌屬），并將其應用于一種受鉛和鎘污染的土壤修復中。該菌株增加了兩種金屬在溶液培養(yǎng)和土壤中的細菌增溶作用，產生吲哚乙酸、鐵載體和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶，并溶解無機磷酸鹽。此外，該菌株顯著提高了玉米（Zea mays）和番茄（Lycopersicon esculentum）植株的生物量，提高了植物組織中鉛和銅的積累。Babu et al.（2013）用從樟子松（Pinussylvestris var. mongholica）根部分離出的細菌菌株接種于土壤中，顯著增加了赤楊木（Alnus japonica）幼苗的生物量和重金屬（砷、銅、鉛、鎳和鋅）的積累作用。伯克氏菌（Burkholderia）強化了土壤中重金屬的去除效率：鉛31%，砷32%，鋅44%，鎘37%，錳52%，銅24%（Yang et al.，2016）。Ma et al.（2015）研究發(fā)現(xiàn)伴礦景天（Sedum plumbizincicola）顯著增強了鎘的攝?。?3%），而芽孢桿菌（Bacillus）則增強了伴礦景天對鋅的積累（18%）。

叢枝菌根（AM）真菌能促進作物產量增加，有助于抵抗土壤中傳播的病原體，并在某些情況下促進作物對包括重金屬和碳氫化合物在內的土壤污染物的耐受力。盆栽玉米植株接種叢枝菌根真菌可以促進原油污染和未污染土壤中植株的生長。種植密度對于AM接種植物后的原油污染土壤中的重金屬降解具有促進作用（Abdul et al.，2016）。但是，關于AM真菌對植物吸收金屬（包括從受污染土壤中提取重金屬）的影響特性，目前沒有形成一致的結論（Liu et al.，2007）。

3.4 重金屬脅迫條件下生物強化/刺激修復石油烴污染土壤

石油、重金屬類物質對于多數(shù)生物有較大毒害作用，僅有少數(shù)特殊物種能夠有效修復石油烴-重金屬污染土壤，而污染土壤中的生物降解速率又與土壤中微生物種類和數(shù)量有很大關系，所以篩選耐重金屬毒性的優(yōu)質石油烴類降解生物具有重要的實際意義（郭曉燕等，2010）。張勤等（2007）從中國東北石油污染重金屬土壤中分離出3個具有營養(yǎng)多樣化、不需要有機生長因素的假單胞菌菌種P.mendocina（D84016）、P. stutzeri（AB126690）、P.aeruginosaSA-1（DQ854840），該菌種與有機污染物的降解以及重金屬抗性有關。Raju et al.（2015）從亞馬遜雨林中的石油污染地篩選出兩株高效銅去除微生物UEAB3和UEAB6（Geomyces屬），經鑒定這兩種絲狀真菌為液體培養(yǎng)基中銅金屬的最佳生物吸附劑，其適用于受原油污染的土壤的生物修復以及針對金屬銅的額外去除作用。高憲雯等（2013）研究表明微生物能有效促進石油-重金屬復合污染鹽堿土壤中石油烴的降解效率。Ekperusi et al.（2016）研究結果表明，蚯蚓可以有效降解原油污染土壤中的重金屬。

向污染土壤添加營養(yǎng)物質、覆蓋堆肥、調節(jié)土壤pH以及改善土壤含水率等，均能增強生物降解效率。Udosen et al.（2001）研究表明，對于石油烴-重金屬污染土壤的生物強化修復，微生物在降解過程中會產生有機酸以降低土壤的pH值，而受污染土壤的pH值變化，可能會促進重金屬在土壤中的去除效果；用堆肥處理過的土壤修復效果遠強于用鋸屑和灰分處理后的修復效果。單一的植物修復技術或是微生物修復技術，對于石油烴-重金屬復合污染土壤的修復作用很難達到較高的水平，因此在不斷的嘗試中植物-微生物聯(lián)合修復技術應運而生。Achakzai et al.（2012）將叢枝菌根（arbuscular mycorrhizas，AM）真菌Glomus mosseae接種到原油-重金屬污染土壤中，并協(xié)同種植高密度的玉米植株，極大地提高了石油烴、重金屬污染物的去除效率。

4 重質原油脅迫條件下石油污染土壤的微生物修復

石油是世界上的主要能源，環(huán)境中的主要污染物（Rahman et al.，2002）。原油通過氧氣脅迫和直接毒性作用等，對數(shù)量巨大的動、植物和微生物的生存構成極大威脅（Rozas et al.，2000）。API（American Petroleum Institute，用以表示石油及石油產品密度的一種量度，簡稱API度）度小于20°且硫含量通常超過 2%（按重量計）的原油被視為重油。API度小于 10°的原油，密度大于水，被認為是超重油，它們以固體或半固體狀態(tài)存在。常規(guī)原油包含 67%-97%飽和烴和芳香族化合物，2%-33%樹脂和 0.1%-12%瀝青類物質；而重油含有24%-64%的飽和烴和芳香烴，14%-39%的樹脂和11%-45%的瀝青類物質（Santos et al.，2014）。樹脂和瀝青質主要由環(huán)烷芳烴和脂環(huán)鏈組成，最難降解。相較于普通原油，重質原油中的有毒有害成分更高（Minaitehrani，2008），針對重質原油污染土壤的微生物修復方面的相關研究極為必要。重油生物降解研究的主要障礙是尋找能夠在較短的培養(yǎng)時間內降解重油組分（瀝青質和樹脂）并能經受惡劣條件的高效微生物。

4.1 重質原油脅迫條件下的微生物適應機制

重油中含有大量的非烴組分，其組分類別和占比的任何變化都可能顯著改變重油的特性。微生物降解重質原油的途徑應該是先改變其性質。Al-Sayegh et al.（2016）利用一種專性降解菌或者多種組合降解菌，以重油作為碳源和底物，通過氧化芳香環(huán)、螯合金屬和切斷分子間的內部鍵/鏈改變重質原油的物理性質，從而將重質原油轉化為較輕組分，降低原油的粘度，從而達到降解重質原油的目的。

微生物接觸、利用石油疏水底物的一般機制是細胞與烴類直接接觸的界面結合，或者是生物表面活性劑主導條件下的細胞與乳化烴類的界面結合（Wentzel et al.，2007）。生物表面活性劑是微生物為吸附、乳化、濕潤、分散或溶解水不溶物（作為食料）而產生的表面活性化學物質，其主要通過增加油的表面積提高非水相液體（NAPL）、多環(huán)芳烴和其他降解產物的生物利用率（Joshi et al.，2010）。與合成表面活性劑不同，生物表面活性劑是安全、可生物降解的。許多生物表面活性劑不含有膠團（micelles），可直接將表面活化的多環(huán)芳烴傳遞到微生物表面，而不像人工合成表面活性劑膠團內的多環(huán)芳烴一樣難以被生物利用（Makkar et al.，2003）。

4.2 重質原油脅迫條件下的微生物降解機理

微生物降解過程中需以原油作為碳源。高效石油烴類降解菌往往優(yōu)先降解易于降解的烴類物質，而非重質原油（Ali et al.，2013）。重油微生物降解機理是一個復雜的過程，涉及使用一種或多種生物制品（如氣體、酸、溶劑、生物表面活性劑和生物類群等）進行的多種生化反應。微生物技術在石油工業(yè)中的應用包括生物脫硫、生物硝化、生物金屬化和生物降解方面（Singh et al.，2012），這些代表了重油的生物升級過程。關鍵的微生物吸收機制是界面張力（IFT）降低、選擇性堵塞、粘度降低、生物降解和潤濕性改變，影響的因素有孔隙、滲透性、壓力、溫度、溶解氣體、pH、鹽度和API重力（Gao et al.，2011）。

微生物降解過程可以產生多種產物，促進重油進一步降解。例如，鏈球菌BT-003（鏈球菌屬）產生的有機酸、生物氣和多糖（生物聚合物）等產物有助于重油的生物降解。該類產物可使重油乳化，重油粘度從 8000-15000 mPa·s降至 50-250 mPa·s（Xu et al.，2009）。甲基營養(yǎng)芽孢桿菌 USTB菌株產生的糖脂類生物表面活性劑，在約為 38 mg·L-1的臨界濃度條件下，將水的表面張力降低到28 mN·m-1，展現(xiàn)了其乳化活性，提高了重油的生物降解能力（Chandankere et al.，2014）。

4.3 重質原油脅迫條件下的微生物降解特性與修復效果

油組分的生物降解效率一般按以下順序降低：正構烷烴、支鏈烷烴（branched-chain alkanes）、支狀烷烴（branched alkanes）、低分子量正構烷烴、單芳烴、環(huán)烷烴、多環(huán)芳烴和瀝青質。Rahman et al.（2002）研究表明C8-C11完全降解，其次是C12-C21、C22-C31和C32-C40，其降解率分別為100%、83%-98%、80%-85%和57%-73%。Parviz et al.（2011）從重質原油中分離出一種新型耐油菌株ERCPPI-1（腸桿菌屬），它在濃度為0.25%-10%重油、溫度高達70 ℃、壓力高達6000 Pa、pH值為4-10、鹽度高達15%的環(huán)境中具有良好的生物降解能力。細菌菌株garciaella petrolearia TERIG02比大多數(shù)微生物更傾向于有毒的瀝青和芳香化合物，當瀝青是唯一的碳源時，可以將重油粘度（50 ℃時為2637 cp）降低37%，當添加糖蜜時降低42%。生物氣體和生物溶劑是降低表面和界面張力和乳化過程的主要原因。陰溝腸桿菌 ERCPPI-1菌株以重質原油為唯一碳源，經21 d培養(yǎng)，在重質原油0.25%（w/v）濃度下，降解率最高可達76.3%，產生生物表面活性劑，具有較高的油擴散和乳化性能。然而，在10%的重質原油濃度下，菌株的降解率僅為 19.1%（Abdullah et al.，2016）。

采用一種以上的細菌菌株來提高生物降解能力是一種有吸引力的選擇。Rahman et al.（2002）研究表明，混合細菌菌團（在原油濃度為 1%時，BH原油降解率為78%）比單獨菌株（在同一濃度下，假單胞菌 DS10-129降解率為 66%和黃桿菌DS5-73降解率為 41%之間）具有更高的細菌生長速率和原油降解率。Cameotra et al.（2008）研究表明，在微生物、營養(yǎng)液以及生物表面活性劑的共同作用下，原油的總體降解率超過98%。Tavassoli et al.（2012）研究表明，在5種菌株的混合培養(yǎng)體系中，瀝青質的生物降解率為48%，超過了有史以來最高的瀝青質生物降解結果（35%）。一般而言，與好氧條件下的微生物生長相比，厭氧條件下的烴類降解微生物生長緩慢。然而鏈球菌 BT-003菌株的實驗結果證明，厭氧條件下的重油降解效果具有與好氧降解相媲美的可能性（Xu et al.，2009）。

5 結論及展望

利用極端微生物修復各類極端環(huán)境下的石油污染土壤，目前主要停留在分離培養(yǎng)和降解特性研究階段，對于降解機制和生存機制等的機理理解不充分，菌種特性待提升，工藝參數(shù)待優(yōu)化，理論研究與實際應用存在較大脫節(jié)。日后的創(chuàng)新研究可聚焦于以下幾個方面：（1）加強高效降解菌的篩選、育種以及極端酶基因工程等工作，探索極端條件下微生物的降解機制和生存機制；（2）培育能夠降解重質石油組分（瀝青質和樹脂）并能在較短的培養(yǎng)時間內承受惡劣環(huán)境的高效微生物；（3）石油降解是由多種微生物共同代謝完成，應加強對菌群構建的研究，尋找不同種降解菌合適的混合比例，以達到較好的石油去除效果；（4）極端條件及其工藝參數(shù)的選擇，應來源于生產實踐，并為生產實踐服務；（5）加大面向實際修復工程的應用基礎研究和技術研發(fā)，促進石油污染土壤的生物修復技術工程化應用；（6）注重相關學科的交叉與滲透，注重新技術、新方法、聯(lián)合修復技術的使用；（7）加強生物修復石油烴污染土壤的風險評估工作。