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      秸稈生物酶法制備可發(fā)酵葡萄糖和木糖的分析研究

      2019-07-18 08:43:06慈元釗付玲弟周凱旋
      生物化工 2019年3期
      關(guān)鍵詞:聚糖緩沖液水解

      慈元釗,付玲弟,周凱旋

      (山東尤特爾生物科技有限公司,山東濟(jì)寧 273500)

      我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó),農(nóng)業(yè)秸稈每年的產(chǎn)量約為8億噸,大量的農(nóng)業(yè)秸稈基本都沒(méi)有得到有效的利用,焚燒、隨意丟棄是主要的處理方式,帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。[1-3]

      秸稈的主要成分是纖維素、半纖維素、木素。纖維素是由數(shù)以萬(wàn)計(jì)葡萄糖分子聚合而成,半纖維素是由戊糖、己糖和糖酸所組成的不均一聚糖,為異質(zhì)多糖。[4]纖維素、半纖維素均可通過(guò)降解產(chǎn)生單糖分子,產(chǎn)生的單糖可進(jìn)行生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇、L-乳酸等。

      大部分的實(shí)驗(yàn)研究都對(duì)秸稈粉末進(jìn)行了化學(xué)或物理方法預(yù)處理?;瘜W(xué)方法主要是由稀酸、稀堿、氨水等浸泡。利用稀酸預(yù)處理容易造成設(shè)備的腐蝕,水解液中產(chǎn)生糠醛、呋喃等物質(zhì);堿法處理的預(yù)水解液中有大量的木素等物質(zhì)溶出,后續(xù)預(yù)水解液處理麻煩。物理方法主要通過(guò)對(duì)秸稈粉末進(jìn)行微波、蒸汽爆破等,需要消耗大量的能量,與我國(guó)節(jié)能減排的大方向不一致。還有一些進(jìn)行物理化學(xué)相結(jié)合的方式,雖然木質(zhì)纖維素的水解率有了大幅度的提升,但實(shí)際運(yùn)用起來(lái)困難重重并不現(xiàn)實(shí)。

      王安東等研究了秸稈雙酶糖化,但秸稈糖化率較低,也不適合推廣。[5]本研究使用尤特爾生產(chǎn)的纖維素酶、木聚糖酶進(jìn)行處理秸稈粉末,分析不同酶用量以及反應(yīng)時(shí)間下的水解率,為利用秸稈進(jìn)行生產(chǎn)L-乳酸做好理論基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。

      1 實(shí)驗(yàn)

      1.1 實(shí)驗(yàn)材料

      玉米秸稈購(gòu)自山東鄒城農(nóng)村,粉碎至1mm左右,置于干燥處備用;纖維素酶、木聚糖酶為山東尤特爾生物科技有限公司生產(chǎn)。

      1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

      SP-56型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),DIOONEX-5000離子色譜儀。

      1.3 實(shí)驗(yàn)方法

      1.3.1 酶活測(cè)定

      纖維素酶測(cè)定參照中華人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB2583-2003,木聚糖酶測(cè)定參照QB/T4483-2013。

      1.3.2 酶活pH、溫度曲線(xiàn)測(cè)定

      測(cè)定纖維素酶、木聚糖酶酶活的pH、溫度曲線(xiàn),選擇最優(yōu)的處理?xiàng)l件。

      1.3.3 酶解反應(yīng)條件

      按1:10的料液比添加最適酶活的pH緩沖液,然后分別加入相應(yīng)用量的纖維素酶、木聚糖酶混勻,放入已升溫至最佳酶活條件下的電熱恒溫水浴振蕩鍋中分別反應(yīng)0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h后取出,振蕩速度為150r/min。放入沸水浴中煮沸10 min,冷卻,離心。離心得到的殘?jiān)偌尤ルx子水洗滌3遍,每遍加水25ml,每次洗滌后離心取上清液,將所有的上清液混合一起測(cè)量體積,并測(cè)定還原糖濃度,比較不同酶用量以及處理時(shí)間下對(duì)秸稈的降解效果,以酶解時(shí)間為0h的為對(duì)照組。

      1.3.4 實(shí)驗(yàn)分析方法

      秸稈組成成分分析。測(cè)定處理前的秸稈中水分、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的組分,分析方法參照《制漿造紙分析與檢測(cè)》中的測(cè)試方法[6]。

      還原糖測(cè)定。酶降解秸稈產(chǎn)生的單糖采用離子色譜進(jìn)行分析。

      2 結(jié)果分析與討論

      2.1 酶活測(cè)定

      經(jīng)測(cè)定計(jì)算,本次實(shí)驗(yàn)所用的纖維素酶酶活(CMC)在酸性條件下為3500IU/mL;木聚糖酶酶活在中性條件下為98120IU/mL。

      2.2 酶活變化曲線(xiàn)的繪制

      測(cè)定了纖維素酶、木聚糖酶在pH4.0-9.0,溫度30-80℃下的酶活。酶活保留率曲線(xiàn)如圖1。

      從酶活保留率曲線(xiàn)來(lái)看,纖維素酶在pH5.5,溫度60℃條件下有最大的酶活,pH在5.0-6.0,溫度在50-80℃范圍內(nèi),酶活保留率均在60%以上。木聚糖酶在pH6.5,溫度50℃條件下有最大的酶活,pH在5.5-7.0,溫度在40-60℃范圍內(nèi),酶活均保留在80%以上。說(shuō)明尤特爾纖維素酶、木聚糖酶的適用范圍較為廣泛。

      2.3 秸稈組分分析結(jié)果

      秸稈組成成分為纖維素37.43%;半纖維素23.18%;木質(zhì)素21.03%;水分10.2% 。

      2.4 秸稈酶解的單因素實(shí)驗(yàn)

      2.4.1 纖維素酶酶用量對(duì)秸稈水解的影響

      稱(chēng)取3g(絕干)秸稈粉,以固液比1:10的比例添加pH5.5緩沖液,根據(jù)纖維素酶的最適反應(yīng)條件置于60℃恒溫振蕩水浴鍋中預(yù)熱十分鐘,振蕩速度為150r/min。然后以50IU/g(絕干)、100IU/g、150IU/g、200IU/g、250IU/g、300IU/g、400IU/g、500IU/g 加 入纖維素酶稀釋液。在此條件下,反應(yīng)48h取出,測(cè)定葡萄糖含量,計(jì)算水解率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。

      秸稈的水解率隨纖維素酶用量的增加逐漸增加,但用量超過(guò)300IU/g時(shí),水解率提升并不顯著,從使用成本考慮,酶用量選擇300IU/g。由于纖維素酶的作用位點(diǎn)是固定的,隨著用量的增加,發(fā)生反應(yīng)的位點(diǎn)增加,但是酶用量大于作用位點(diǎn)時(shí),水解率便不再大幅度提高。

      2.4.2 纖維素酶處理時(shí)間對(duì)秸稈水解的影響

      實(shí)驗(yàn)方法參照2.3.1。纖維素酶添加量為300IU/g。在此條件下,每隔12小時(shí)取出一個(gè)樣品沸水浴滅活10min。測(cè)定水解率,結(jié)果如圖3。

      隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),水解率逐漸提升,反應(yīng)48h以后,水解率提升幅度越來(lái)越小。為了節(jié)約成本可將水解時(shí)間調(diào)整為48h。纖維素酶的處理時(shí)間越長(zhǎng),秸稈中的纖維素含量越低,水解率增加幅度也逐漸降低。

      2.4.3 木聚糖酶酶用量對(duì)秸稈水解率的影響

      實(shí)驗(yàn)方法參照2.3.1,緩沖液使用pH6.5的緩沖液,反應(yīng)溫度50℃,酶用量分別為100IU/g(絕干)、200IU/g、300IU/g、400IU/g、500IU/g、600IU/g、700IU/g、800IU/g。反應(yīng)時(shí)間48h,反應(yīng)完畢測(cè)定水解率。結(jié)果如圖2所示。

      木聚糖酶處理后的秸稈水解率相對(duì)纖維素酶處理的較低,木聚糖酶用量在500IU/g以上時(shí),水解率提升速率較低,因此用量選擇500IU/g。木聚糖酶主要降解秸稈中的半纖維素組分,因?yàn)榻斩捴邪肜w維素與纖維素、木質(zhì)素相互交纏,半纖維素含量又相對(duì)較低,因此其水解率明顯低于纖維素的水解率。

      2.4.4 木聚糖酶酶處理時(shí)間對(duì)秸稈水解的影響

      實(shí)驗(yàn)方法與條件參照2.3.3,酶用量選擇500IU/g,每隔12h取出一個(gè)樣品沸水浴滅活10min。測(cè)定水解率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。

      隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),半纖維素的水解率逐漸增高,48h以后水解率提升幅度較低,因此最佳處理時(shí)間選擇48h。

      圖2 不同酶用量下的水解率

      圖3 不同處理時(shí)間下的水解率

      2.5 混合酶處理秸稈

      根據(jù)各單因素實(shí)驗(yàn),確定纖維素酶、木聚糖酶的用量分別為300IU/g、500IU/g。綜合兩種酶在不同pH以及溫度下的酶活保持率,最終選擇反應(yīng)條件pH5.5,溫度50℃。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)每隔12h取出一個(gè)樣品測(cè)定水解率,結(jié)果如圖4。

      圖4 混合酶不同處理時(shí)間下的水解率

      纖維素酶與木聚糖酶混合使用以后水解率比單獨(dú)使用兩種酶的綜合效果要好,水解率在72h達(dá)到最高,但到84h時(shí)水解率有所降低,是由于水解液中細(xì)菌的生長(zhǎng),使得水解率呈下降趨勢(shì)。實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中,可在酶解之前對(duì)秸稈進(jìn)行滅菌處理,同時(shí)高溫也會(huì)導(dǎo)致秸稈的纖維疏松,提高水解率。

      3 結(jié)論

      實(shí)驗(yàn)過(guò)程先測(cè)定纖維素酶、木聚糖酶的酶活變化曲線(xiàn),為秸稈酶解條件的選擇節(jié)省了大量的時(shí)間和精力。纖維素酶直接處理秸稈粉末,水解率最高可達(dá)27.5%。木聚糖酶單獨(dú)使用時(shí),其最高水解率可達(dá)15%。而在兩種酶的共同作用下,最高水解率為43.1%。

      生物酶法直接處理秸稈粉末,目前雖然水解率沒(méi)有使用化學(xué)方法預(yù)處理后再使用酶處理的高,但酶法條件溫和,較容易操作,對(duì)環(huán)境影響較小。是當(dāng)前比較理想的一種行之有效地秸稈處理方法。

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