單因素考察甘草瀉心湯超微飲片中甘草酸提取工藝研究

吳柱，譚軍華，王靈芝，魏丹丹，3

（1.長沙醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410219；2.湖南省九典制藥股份有限公司，湖南長沙 410329；3.湖南易能生物醫(yī)藥有限公司，湖南長沙 410006）

甘草瀉心湯出自《傷寒論》，處方組成為甘草四兩（君）、黃芩三兩、干姜三兩（臣）、半夏半升、人參三兩（佐）、黃連一兩、大棗十二枚（使），主治傷寒，醫(yī)反下之，并自利，心下痞硬，干嘔，心煩不安。目前，甘草瀉心湯臨床應(yīng)用廣泛，在消化系統(tǒng)、腫瘤化療后消化道、艾滋病難治性口腔潰瘍、糖尿病、皮膚瘙癢癥等治療中效果突出[1-3]。方劑中甘草是君藥，君甘草以保胃氣，瀉心，非瀉結(jié)熱，因胃虛不能調(diào)劑上下，致水寒上逆，火熱不得下降，結(jié)為痞，甘草的主要有效成分為甘草酸。

目前對甘草瀉心湯研究僅限于作用機(jī)制和臨床療效，關(guān)于甘草瀉心湯超微飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方面至今無相關(guān)報(bào)道。本論文旨在對甘草瀉心湯超微飲片提取工藝進(jìn)行研究，采用HPLC法測定甘草酸，為甘草瀉心湯超微飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1100高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）等。

甘草、黃芩、干姜、半夏、人參、黃連、大棗，購于湖南九芝堂零售有限公司撈刀河藥店，于湖南中醫(yī)藥研究院分別超微粉碎；98%甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品（上海西隴生化科技有限公司 ST0125），色譜甲醇（天津歐博凱化工有限公司，180810）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝研究

2.1.1 簡單回流提取

將甘草瀉心湯超微粉末精密稱量12 g至圓底燒瓶中，加入一定量的溶劑（溶劑分別為乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇）浸泡靜置30 mim，然后按照固液比1∶20[4]的比例加入溶劑共240 mL，回流提取3次，時(shí)間分別為 2 h、1.5 h、1 h，將提取液過濾，濾液濃縮成浸膏。

2.1.2 連續(xù)回流提取

將甘草瀉心湯超微粉末按比例精密稱取12 g至濾紙?zhí)變?nèi)，加入一定量的溶劑（同2.1.1）至索氏提取器浸漬30 min，圓底燒瓶加入240 mL溶劑，回流提取4.5 h，過濾，濾液濃縮成浸膏。

2.1.3 超聲提取

將甘草瀉心湯超微粉末精密稱量12 g至圓底燒瓶中，加入一定量溶劑（同2.1.1）浸泡靜置30 min，

置于35 ℃的超聲儀中超聲（125 W，55kHz）2 h、1.5 h、1 h[5]，過濾，濾液濃縮成浸膏。

單因素考察不同提取溶劑和方法對甘草瀉心湯超微粉末的影響結(jié)果見表1。

表1 三種不同提取溶劑及方法所得浸膏重

表1結(jié)果顯示，以浸膏得率為評價(jià)指標(biāo)，以95%乙醇為溶劑采用連續(xù)回流提取所得浸膏得率為37.52%，故此提取方法為最佳提取工藝。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液配制

取甘草酸對照品25 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入40 mL甲醇溶解，超聲（300 W，40 kHz）30 min，放冷，定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液配制

將甘草瀉心湯超微飲片精密稱取12 g，按“2.1.2項(xiàng)”下提取，溶劑采用95%乙醇，濾液濃縮成浸膏。浸膏加 10 mL 甲醇溶解，精密量取 5 mL，至 25 mL 容量瓶中，加15 mL甲醇溶解，超聲處理（300 W，40 kHz）30 min，放冷，定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性對照樣品配制

將不含甘草的甘草瀉心湯超微粉末按比例精密稱量12g至濾紙?zhí)變?nèi)，按照供試品溶液的制備方法制備即得。

2.3 色譜條件

色 譜 柱:Hyper ODS2 C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動(dòng)相:甲醇 -0.2 mol/L乙酸銨 -冰醋酸（67 ∶33 ∶1）；柱溫:30 ℃；流速:1 mL/min；波長:247 nm；進(jìn)樣量:20 μL。

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液、對照品溶液和陰性樣品進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1。

從圖1中A與B可知，在此測定條件下，甘草酸的峰形穩(wěn)定，保留時(shí)間為13.00min左右，圖C可知，陰性對照樣品無干擾。

2.4 線性關(guān)系的考察

分別配制甘草酸的對照品溶液（50、100、150、200 μg/mL 和 250 μg/mL)，按 2.3 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以甘草酸濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積（A）為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為 Y=17112X -234.69，R2= 0.999。結(jié)果表明:甘草酸對照品在50～250 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 甘草瀉心湯超微粉末中甘草酸HPLC圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液（150 μg/mL）20 μL注入色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，RSD為0.86%，表明實(shí)驗(yàn)儀器的精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液，于室溫放置，分別于 0、2、4、6、12 h和 24 h各進(jìn)樣 1次，每次20 μL，測定甘草酸峰面積，RSD為1.92%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取同一批供試品溶液12 g，按2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液制備6份，按2.3項(xiàng)下條件分別進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，RSD為1.98%，表明該法重復(fù)性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批樣品9份，分別精密加入高、中、低甘草酸對照品儲備液，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理制成供試品溶液，依法進(jìn)行含量測定，計(jì)算回收率，甘草酸的平均回收率為99.81%，RSD為1.95%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

取3批10倍量甘草瀉心湯超微粉末，按最優(yōu)提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得三批超微粉末甘草酸含量為360.34、358.28、370.35μg/ml，RSD值為1.77%，說明該提取工藝穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

通過對甘草瀉心湯超微飲片提取工藝的單因素進(jìn)行考察，以得膏率為評價(jià)指標(biāo)，以乙醇為提取溶劑的連續(xù)回流提取法（索式提取）所得粗提物量最多，且該方法不僅簡單，易重復(fù)，而且具有明顯的實(shí)用性，可作為甘草瀉心湯超微飲片提取工藝。

本研究摸索甘草瀉心湯超微飲片甘草酸含量測定色譜條件，通過全波長掃描確定在247 nm為檢測波長，流動(dòng)相以甲醇-0.2 mol/L乙酸銨-冰醋酸（67∶33∶1）為流動(dòng)相所得到的色譜圖中，化合物的分離效果好，色譜峰形佳且相對穩(wěn)定。

采用HPLC方法建立了甘草瀉心湯超微飲片定量測定方法，所建立的色譜條件簡單，適宜于經(jīng)典名方甘草瀉心湯甘草酸化合物含有量測定，有很好的實(shí)用性。

為傳承發(fā)展中醫(yī)藥事業(yè)，經(jīng)典名方的開發(fā)受到國家的重視，甘草瀉心湯原方用作治療狐惑病，隨著醫(yī)學(xué)的研究，其治療范圍漸漸拓寬，但對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究無相關(guān)報(bào)道，本研究所得結(jié)果為甘草瀉心湯超微粉末的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定的參考。