西藏羊肚菌水提物的抗氧化活性研究

楊小斌，曾榮華，鄧穎詩，魏星，許文東，袁誠，關偉鍵，王浩

（1.中藥提取分離過程現(xiàn)代化國家工程研究中心 廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司，廣東廣州 510240；2.西藏林芝廣藥發(fā)展有限公司 中藥提取分離過程現(xiàn)代化國家工程研究中心藏藥分中心，西藏波密 850300）

羊肚菌（Morchella esculenta）在我國主產(chǎn)于西藏、甘肅、湖南、青海、云南、新疆、四川、山西等地[1]。近幾年，有關羊肚菌的研究內(nèi)容主要涉及地理環(huán)境、資源分布、生長周期、人工栽培、功能、藥理作用以及產(chǎn)品開發(fā)等方面[2]。

羊肚菌含粗蛋白20%、粗脂肪26%、碳水化合物38.1%，還含有多種氨基酸、黃酮、色素、多糖、皂甙類等成分[3-4]，是一種珍稀的食藥兩用真菌，屬高級營養(yǎng)滋補品。羅霞等[5]研究指出，尖頂羊肚菌菌絲體水提液能增加胃黏液分泌，并且提高機體的抗氧化能力，對酒精引起的大鼠急性胃黏膜損傷有保護作用。吳映明等[6]發(fā)現(xiàn)羊肚菌提取液可明顯加強正常小鼠的胃腸運動，新斯的明負荷小鼠食用羊肚菌提取液，對其胃腸推進亢進也有明顯的拮抗作用。殷偉偉等[7]對尖頂羊肚菌活性提取物的降血脂作用的研究發(fā)現(xiàn)，一個實驗周期后，發(fā)現(xiàn)尖頂羊肚菌活性提取物能顯著地降低高脂模型小鼠血清TC、TG、LDL-C、脾指數(shù)和腎指數(shù)，具有良好的降血脂效果。Kalyoncu等[8]研究了不同真菌菌絲體的抗氧化效果，發(fā)現(xiàn)高羊肚菌乙醇提取物清除羥基自由基的能力最強，抗氧化活性最好。Kim等[9]研究表明羊肚菌提取物能有效清除結腸癌細胞HT-29羥基自由基，抗氧化效果顯著。趙英等[10]從DPPH自由基清除能力、還原能力和羥基自由基清除能力3個方面評估了羊肚菌甲醇提取物的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)羊肚菌在不同抗氧化途徑中均具有良好的抗氧化活性，說明羊肚菌中含有某些具有抗氧化能力的化合物。

目前，對羊肚菌營養(yǎng)素和功能成分的研究趨向于蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)，對氨基酸、微量元素的研究僅限于生物學水平，沒有對其進行深入的研究[11]。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）作為一種簡單的模式生物，具有生長周期短、遺傳背景清晰、表型容易觀察等優(yōu)點[12]，在生命科學研究領域中發(fā)揮了重要作用，并在用于植物提取物的抗氧化損傷方面的研究中具有重要的應用價值[13]。本研究以秀麗隱桿線蟲為實驗模式生物，對羊肚菌水提取物的體內(nèi)抗氧化活性進行研究，觀察其正常壽命、產(chǎn)卵量、運動行為、體內(nèi)脂褐素含量（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活力的影響，旨在為相關產(chǎn)品開發(fā)應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

1.1.1 主要試劑

羊肚菌水提物，實驗室提??；秀麗隱桿線蟲（C.elegans）:N2野生型秀麗隱桿線蟲及大腸桿菌OP50由遺傳學中心所提供。LB肉湯:廣東環(huán)凱微生物技術有限公司；胰蛋白胨:廣東環(huán)凱微生物技術有限公司；H2DCF-DA（2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯）:Sigma公司；SOD試劑盒、CAT試劑盒:南京建成生物工程研究所；其余均為分析純。

1.1.2 主要設備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺（上海博恒實業(yè)有限醫(yī)療設備廠）、萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、TGL-16B高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）、UV-3010紫外分光光度計（日本日立高科技公司）、Enspire2003多功能酶標儀（美國pE公司）、FD-4型冷凍干燥機（labCAN）。

1.2 實驗方法

1.2.1 羊肚菌水提物制備

準確稱取50 g羊肚菌粉末（購于西藏林芝縣）于1 000 mL 圓度燒瓶中，加水 500 mL，100 ℃回流提取90 min，過濾，濾渣回流提取 60 min，抽濾合并提取物，旋轉蒸發(fā)、濃縮、真空冷凍干燥，配制成濃度為0、25、100、200 mg/mL的羊肚菌水提物溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)

線蟲生長培養(yǎng)基（Nematode Growth Medium，NGM）參考文獻[14]。配制不同濃度（0、25、100、200 mg/mL）的羊肚菌水提物溶液，過濾除菌后，與大腸桿菌OP50菌液以5∶95的比例混合均勻。吸取100 μL樣品于NGM平板上，喂養(yǎng)線蟲。生長到L4期的線蟲即可進行同期化。約48 h后線蟲受精卵基本發(fā)育成L4期幼蟲，完成同期化，可用于各項指標測定。

1.2.3 對秀麗隱桿線蟲壽命的影響測定

挑取同期化后的L4期線蟲到各組培養(yǎng)基當中，每個板中約有30條，每組設3個平行。從轉移時刻起開始計算線蟲的存活天數(shù)，轉移當天記為實驗的第0天，每天將它們轉移到新的培養(yǎng)皿當中，到第4天后隔天將線蟲轉移到新的平板中以保證食物的充足。隔天探視線蟲，并記錄線蟲死亡數(shù)。對線蟲死亡判斷標準為無移動及吞咽等動作，輕觸后仍然無任何反應[15]。

1.2.4 對秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵量的測定

每組挑取10條處于L4時期的線蟲到各組培養(yǎng)基中，每個平板中放置2條線蟲。每隔24 h后將線蟲轉移至新的平板中，轉移4～5次后，線蟲基本上已經(jīng)不再產(chǎn)卵。將所有平板繼續(xù)在培養(yǎng)箱中20 ℃孵育24 h后，待子代線蟲孵化長大后，在其進入產(chǎn)卵期之前，對線蟲的數(shù)目進行計數(shù)，計算每條母線蟲在6～7個平板中產(chǎn)卵數(shù)的總和就是該線蟲的產(chǎn)卵數(shù)量。

1.2.5 對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS水平的影響

ROS水平測定:經(jīng)羊肚菌水提物處理96 h以后，將不同濃度組線蟲轉移到NGM板上以去除大腸桿菌。轉移3次后，把線蟲轉移到含有50 μL的M9緩沖液的96孔熒光板上，每孔轉移80條，每組設三個平行。與此同時將50 μL用M9緩沖液配制的100 μM的H2DCF-DA溶液加入到96孔板當中，用不含線蟲的 H2DCF-DA 溶液50 μL 加 50 μL M9緩沖液做空白對照。立即將96孔板放入酶標儀當中測定熒光強度，反應溫度25 ℃，發(fā)射波長528 nm，激發(fā)波長485 nm。每次讀數(shù)前振蕩，每隔20 min測定一次，共反應 6 h。

1.2.6 羊肚菌水提物對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD和CAT酶活力的影響

前期培養(yǎng)方法與壽命實驗一樣，經(jīng)藥物處理96 h以后，分別從空白組、樣品組和陽性對照組挑200條線蟲放入無菌水中沖洗，低速離心后去掉上清液，反復三次后定容至0.5 mL，低溫勻漿（重復勻漿2次，1 s勻漿、1 s間隙，每次2 min）。勻漿后加入1%chap溶液定容至 1 mL，低溫離心（4 ℃，12 000 r/min，15 min），收集上清液放置到4 ℃中待測。酶活力的測定，嚴格按照南京建成生物工程所SOD和CAT測試盒說明書要求的操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

將不同濃度條件下得到的各組數(shù)據(jù)即線蟲壽命、體長、線蟲一分鐘活動次數(shù)和線蟲體內(nèi)熒光密度等數(shù)據(jù)使用Origin軟件進行繪圖，SPSS17.0 軟件數(shù)據(jù)處理，進行差異顯著性檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 羊肚菌水提物對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

本實驗通過比較3個不同濃度的羊肚菌水提物樣品對秀麗隱桿線蟲壽命的影響，對線蟲整個壽命周期的存活率做出壽命生存曲線圖，如圖1所示。羊肚菌水提物處理組秀麗隱桿線蟲的平均壽命、最長壽命均高于對照組，且與羊肚菌水提物濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應關系。100 mg/L與200 mg/mL組秀麗隱桿線蟲的平均壽命顯著高于對照組（P＜0.05），說明羊肚菌水提取物可以顯著延長秀麗隱桿線蟲壽命。但是，當質(zhì)量濃度達到100 mg/mL時，秀麗隱桿線蟲壽命提升率無顯著差異（P＞0.05），結果如表1所示。

圖1 羊肚菌水提物對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

表1 對線蟲壽命的影響

2.2 羊肚菌水提物對秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵量的影響

由不同濃度（0、25、100、200 mg/mL）的羊肚菌水提物溶液喂養(yǎng)線蟲的總產(chǎn)卵量實驗結果見表2。25 mg/mL羊肚菌水提物組秀麗隱桿線蟲子代數(shù)量達到248個，顯著高于對照組（p＜0.05）。而且線蟲產(chǎn)卵量隨著羊肚菌水提物濃度的增加而增加，25 mg/mL、100 mg/L、200 mg/L組間線蟲產(chǎn)卵量均無顯著性差異（p＞0.05）。本實驗結果說明本研究所得羊肚菌水提物能提高線蟲產(chǎn)卵量，但濃度的增加不會對秀麗隱桿線蟲生殖能力造成顯著影響（p＜0.05）。

表2 羊肚菌水提物對秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵量的影響

2.3 羊肚菌水提物對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS的影響

由表3可知，與對照組相比，羊肚菌水提物能夠顯著降低線蟲體內(nèi)ROS積累量（p＜0.05），而且隨著濃度的增大，ROS越小，100 mg/L與200 mg/L羊肚菌水提物組ROS水平分別下降了37.44%和23.50%，組間無顯著差異。

表3 羊肚菌水提物對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS的影響

2.4 羊肚菌水提物對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD和CAT酶活的影響

如圖2所示，在考察質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，羊肚菌水提物均可以顯著提高秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD、CAT活力（P＜0.05）。對照組0 mg/mL的羊肚菌水提物組的 CAT 活力為（150.05±1.00）U/mg prot，與對照組相比，25 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL 羊肚菌水提物組使CAT活力分別提高了26.11%、31.52%和37.41%。

如圖3所示，不同濃度羊肚菌水提物組的SOD活力均極顯著高于對照組（P＜0.01）。與對照組相比，25 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL 羊肚菌水提物組使SOD活力分別提高了55.46%、66.40%和75%。25 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL 羊肚菌水提物組間對SOD活力的影響無顯著差異。

圖2 羊肚菌水提物對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)CAT的影響

圖3 羊肚菌水提物對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD的影響

3 結論

秀麗隱桿線蟲作為一個完整且簡單的生命體，以其低成本、高效率的特點在活性成分評價方面優(yōu)于小鼠等其他模式生物[16]，在植物提取物的體外和體內(nèi)抗氧化活性之間架起了一座橋梁[17]，是研究植物提取物的抗氧化作用不可或缺的工具[18-19]。本研究以秀麗隱桿線蟲為實驗模式生物，對羊肚菌水提取物的體內(nèi)抗氧化活性進行研究，觀察其正常壽命、產(chǎn)卵量、體內(nèi)脂褐素含量（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活力的影響，發(fā)現(xiàn)羊肚菌水提物處理組秀麗隱桿線蟲的平均壽命、最長壽命均高于對照組，且與羊肚菌水提物濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應關系。線蟲產(chǎn)卵量隨著羊肚菌水提物濃度的增加而增加，但濃度的增加不會對秀麗隱桿線蟲生殖能力造成顯著影響（p＜0.05）。與對照組0 mg/mL相比，羊肚菌水提物能夠顯著降低線蟲體內(nèi)ROS積累量（p＜0.05），而且隨著濃度的增大，ROS越小，100 mg/L下降了37.44%和200 mg/L 23.50%。羊肚菌水提物均可以顯著提高秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD、CAT活力p＜0.05）。與對照組相比，25 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL羊肚菌水提物組使SOD酶活力分別提高了55.46%、66.40%和75%；使CAT活力分別提高了26.11%、31.52%和37.41%。

綜上所述，羊肚菌水提物可以提高相關抗氧化酶活力、有效減少線蟲體內(nèi)脂褐素積累、使得線蟲壽命得到有效延長，改善機體的抗氧化能力。