柱前衍生化HPLC法分離不同聚合度的殼寡糖

鐘碧萍，吳曉青，周津，謝茹勝

（福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福州 350002）

殼寡糖是殼聚糖降解產(chǎn)物，聚合度一般為2～10。殼寡糖具有良好的水溶性和生物活性[1]，具有抗菌抑菌、調(diào)節(jié)人體免疫及抗腫瘤等功能，在食品、醫(yī)藥及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[2]。近年來(lái)，對(duì)殼寡糖的研究取得了很大的成績(jī)，對(duì)殼寡糖的組分分析也是在開(kāi)發(fā)應(yīng)用中需要解決的問(wèn)題，本研究用PMP對(duì)殼寡糖進(jìn)行柱前衍生化，采用高效液相色譜法對(duì)聚合度為2～6的殼寡糖進(jìn)行分析分離，建立一種能較好分離并測(cè)定殼寡糖的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

殼二糖（批號(hào):20170312）、殼三糖（批號(hào):20170523）、殼四糖（批號(hào):20170523）、殼五糖（批號(hào):20160925）、殼六糖（批號(hào):20170523），以上對(duì)照品均購(gòu)自西寶生物科技有限公司，純度均≥98%；PMP（批號(hào):20160921，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜級(jí)，F(xiàn)isher公司）；乙酸銨（分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平（BS120S，d=0.1 mg，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、高效液相色譜儀（LC-20A，日本島津有限公司）、數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 混合對(duì)照溶液制備

精密稱取殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖、殼六糖標(biāo)準(zhǔn)品各25.0 mg于10 mL的容量瓶，加水稀釋定容，配制成濃度均為2.5 mg/mL的溶液。各取1 mL混合制成濃度均為0.5 mg/mL的混標(biāo)溶液。

采用半纖維素酶降解殼聚糖[3]，制備殼寡糖，用 200 mL pH 為 4的乙酸 - 乙酸鈉緩沖液溶解 15 g殼聚糖，而后加入同種緩沖液溶解的10 mg/mL半纖維素酶溶液 10 mL，50 ℃水浴 12 h，得到殼寡糖樣品溶液。

1.2.2 衍生化過(guò)程pH的考察

取5份100 μL的混標(biāo)溶液于5 mL的離心管中，加入100 μL濃度為0.5 mol/L的PMP溶液（取0.4355 g PMP 用甲醇定容至 50 mL 容量瓶），再加入氨水30、50、80、100 、120 μL，渦旋混勻，在 80 ℃水浴中反應(yīng)60 min，用N2吹干，再加入0.5 mL水，加入二氯甲烷1 mL，重復(fù)萃取3次，水相用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，待進(jìn)樣分析。

1.2.3 衍生化過(guò)程PMP用量考察

取5份100 μL的混標(biāo)溶液于5 mL的離心管中，分別加入濃度為0.5 mol/L的PMP溶液30、50、100、150 、200 μL，再加入氨水 50 μL，其余同。1.2.1，待進(jìn)樣分析。

1.2.4 色譜條件的考察

色 譜 柱:C18柱（ 島 津，250 mm×4.5 mm，5 μm）；柱溫:30 ℃；流速:0.9 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm；流動(dòng)相:A 乙腈，B 乙酸銨（0.01 mol/L，pH 4.5）；進(jìn)樣量:10 μL；梯度洗脫，A相（乙腈）比例0～5 min為 10%，6～ 14 min為 25%，15～ 28 min為45%。

1.2.5 方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系考察。取1.2.1配制的混合對(duì)照品溶液，配制成不同濃度的混合對(duì)照品溶液衍生化后按1.2.4的色譜條件進(jìn)樣。

（2）精密度考察。取1.2.1配制的混合對(duì)照品溶液衍生化后按1.2.4的色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，再根據(jù)峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值。

（3）重復(fù)性考察。取同一濃度的樣品溶液6份，同一條件衍生化進(jìn)樣，根據(jù)峰面積計(jì)算含量，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生過(guò)程pH優(yōu)化結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。當(dāng)加入氨水80 μL時(shí)，殼三糖與殼五糖峰面積值最大，殼二糖、殼六糖在加入氨水50 μL時(shí)峰面積值最大，殼四糖隨著氨水加入量的增大而峰面積值增大，但50 μL后增大較為緩慢，故加入氨水80 μL較為合適。

圖1 不同氨水體積作用下各殼寡糖峰面積

2.2 衍生過(guò)程PMP用量結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)PMP加入量少于100 μL時(shí)，各殼寡糖的峰面積都隨著殼寡糖的加入量而增大；隨著PMP加入量的繼續(xù)增加，各殼寡糖的峰面積都維持在最大水平或略微有所下降，故本實(shí)驗(yàn)選擇PMP加入量為 100 μL。

圖2 不同PMP用量作用下各殼寡糖峰面積

2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液衍生化后色譜圖

5種殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品及殼寡糖樣品溶液衍生化后的色譜圖如圖3、圖4所示。色譜分離過(guò)程采用梯度洗脫進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)乙腈比例小于15%時(shí)，色譜峰較寬且分離時(shí)間長(zhǎng)；而當(dāng)乙腈比例大于30%時(shí)，各殼寡糖不能完全分離，故采用梯度洗脫的方式，優(yōu)化結(jié)果為A相比例 0～5 min為10%，6～ 14 min為 25%，15～28 min為45%，并且考察流動(dòng)相醋酸銨的pH，最終確定pH為4.5，濃度為0.01 mol/L的醋酸銨溶液。

圖3 5種殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化后色譜圖

圖4 殼寡糖樣品溶液衍生化后色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

按1.2.3色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，以殼寡糖濃度為橫坐標(biāo)（x），以峰面積為縱坐標(biāo)（y），對(duì)殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，表明本實(shí)驗(yàn)殼二糖至殼六糖線性良好。

表1 5種殼寡糖的回歸方程、相關(guān)系數(shù)

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一濃度樣品溶液衍生化后進(jìn)樣分析，記錄殼二糖、殼三糖、殼六糖峰面積并換算成含量，計(jì)算RSD，結(jié)果分別為1.37%、2.01%、1.15%，表明重復(fù)性良好。

2.6 精密度考察

取1.2.1配制的混合對(duì)照品溶液衍生化進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，并記錄殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖的峰面積，換算成含量，計(jì)算RSD，分別為0.87%、1.26%、1.76%、0.96%，1.58%，表明精密度良好。

3 結(jié)論

隨著殼寡糖越來(lái)越多的功能被開(kāi)發(fā)應(yīng)用，其相應(yīng)的分析檢測(cè)要求也在提高，本研究采用PMP對(duì)聚合度為2～6的殼寡糖進(jìn)行柱前衍生化HPLC分析，建立了殼寡糖柱前衍生化HPLC分離方法。該方法在殼寡糖的組分分析和質(zhì)量控制等方面有一定的研究?jī)r(jià)值。