石林石漠化地區(qū)可培養(yǎng)石生真菌多樣性研究

陳曉溪，熊忠平，李選文，聶中良，張 珊，凌 溪，熊 智

(西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224)

【研究意義】云南省石林縣位于云南東部巖溶高原(滇東巖溶高原)，分布于云南省昆明市石林縣境內(nèi)，地理位置是北緯24°30′～25°03′，東經(jīng)103°10′～103°40′，海拔1600～1950 m[1]。石林地區(qū)是典型的喀斯特景觀，是世界唯一位于亞熱帶高原地區(qū)的喀斯特(溶洞)地貌風(fēng)景區(qū)，素有“天下第一奇觀”、“石林博物館”的美譽(yù)。全縣喀斯特面積超過900 km2，石林分布面積超過350 km2，分布有大量較純的碳酸鹽巖，碳酸鹽巖主要由CaMg(CO3)2含量較高的白云巖和CaCO3含量較高的石灰?guī)r組成。石林以石灰?guī)r較多，巖石CaCO3含量在50 %以上[2]。巖石作為特殊的生境，因其環(huán)境干旱、營(yíng)養(yǎng)缺乏、溫度波動(dòng)大，對(duì)生存于其中的生物具有極大的挑戰(zhàn)，但在巖石表面和裂縫中存在多種類型的微生物，這在很多年前就受到研究者們的關(guān)注[3]。微生物數(shù)量巨大，并且存在于喀斯特地貌中，參與許多喀斯特地區(qū)演化歷程中微觀化學(xué)作用，特別是巖石、礦物的礦化及風(fēng)化作用，土壤的形成等過程[4]。石生真菌(rock-inhabiting fungi，RIF)是指生活在巖石表面或伸入巖石內(nèi)部的一大類微型真菌[5]。石生真菌大多數(shù)生長(zhǎng)緩慢，很少在巖石上與其他生物共生，產(chǎn)生黑色素，分生組織狀生長(zhǎng)，能夠適應(yīng)較嚴(yán)酷的生存環(huán)境，是一個(gè)生態(tài)復(fù)合群，研究表明其具有豐富的物種多樣性[6]。【前人研究進(jìn)展】研究發(fā)現(xiàn)，石生真菌能引起建筑物表面腐蝕。石生真菌會(huì)造成其生長(zhǎng)的巖石表面選擇性吸收太陽輻射，導(dǎo)致巖石晶體局部產(chǎn)生微小裂縫，石生真菌菌絲延伸進(jìn)裂縫，進(jìn)而破壞建筑物整體連續(xù)性[7]。丁麗君等[8]的研究認(rèn)為碳酸鹽巖的微生物風(fēng)化可能是化學(xué)降解、生物降解和酶的作用等因素引起的，微生物可能通過直接接觸或分泌酶等活性物質(zhì)來加速對(duì)碳酸鹽巖的風(fēng)化。目前，關(guān)于石漠化地區(qū)微生物多樣性的研究已有相關(guān)報(bào)道，但石林石漠化地區(qū)石生真菌多樣性的研究卻并未見報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】采集石林石漠化地區(qū)巖石作為研究對(duì)象，采用純培養(yǎng)技術(shù)、形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS序列分析研究石生真菌多樣性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為開發(fā)利用石漠化地區(qū)微生物資源提供理論依據(jù)，并為后期探索微生物在碳酸鹽巖風(fēng)化過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 巖石樣品

巖石樣品采自石林石漠化地區(qū)(圖1)，選擇有黑色微型菌落的巖石，隨機(jī)選取8個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)取樣5份共計(jì)40份巖石樣品。每次采樣前用75 %的酒精沖洗工具(鑿子、小錘、刀片)，鑿取石塊碎片，將巖石與附著的石生真菌一同裝入無菌袋中密封保存，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于4 ℃冰箱中備用[9]。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：新鮮去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，加蒸餾水配制1 L，pH自然；MEA培養(yǎng)基：麥芽浸膏30 g，大豆蛋白胨3 g，瓊脂15 g，加蒸餾水配制1 L，配成溶液后pH值調(diào)至5.6±0.2，以上培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌30 min。

1.3 石生真菌的分離純化及保存

實(shí)驗(yàn)材料的處理參考蘇磊[6]的方法，稍作改變。預(yù)處理：將巖石樣品放置在無菌培養(yǎng)皿中，用95 %乙醇清洗，用無菌解剖刀將巖石樣品鑿成小巖片，將巖石樣品放入含有8 %H2O2溶液的無菌培養(yǎng)皿中消毒4 min，將處理過的巖石樣品用生理鹽水沖洗2次。離心富集菌體：將巖石樣品放入含1 mL 0.1 %吐溫20的1.5 mL無菌離心管中，震蕩培養(yǎng)1 h，3000 r/min離心2 min，用無菌水沖洗，將巖石樣品置于滅菌濾紙上，吸干自由水。用無菌的研缽將巖石樣品研碎，加入5 mL ddH2O?；靹蚝螅謩e吸取300、500、1000 μl懸浮液滴在PDA和MEA培養(yǎng)基上，涂布，28 ℃培養(yǎng)3～4 d，待長(zhǎng)出菌絲后，挑取菌絲最先端，分別接種于PDA和MEA培養(yǎng)基上，觀察生長(zhǎng)情況，檢查特征是否一致，進(jìn)行多次分離與純化，直到獲得純的菌株。經(jīng)分離純化后得到單一菌株，4 ℃ 砂土管法保存。

1.4 石林石生真菌形態(tài)觀察及分類

采用插片法進(jìn)行石生真菌形態(tài)學(xué)顯微觀察[9]。參照《真菌鑒定手冊(cè)》[10]、《真菌分類學(xué)》以及Mycobank 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫[11](http：//www.mycobank.org/)對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.5 石生真菌DNA抽提及PCR擴(kuò)增

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取石林石生真菌基因組DNA。抽提產(chǎn)物經(jīng) 1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將合格的DNA抽提物作為ITS序列擴(kuò)增模板。擴(kuò)增引物[12]：ITS1(5’-CCGATGGTAACCTGCGG-3’)；ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)(引物由昆明碩擎生物科技有限公司合成)。PCR擴(kuò)增體系為50.0 μl：Mix為25.0 μl；ITS1為2.0 μl；ITS4為2.0 μl；模板DNA為2.0 μl；雙蒸水補(bǔ)充至50.0 μl。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性45 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min[13]。

圖1 部分巖石樣本采樣點(diǎn)Fig.1 A few of sampling points

表1 石生真菌分離結(jié)果Table 1 Isolation results of rock-inhabiting fungi

取4.0 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液混合，通過1.0 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。檢測(cè)合格后送昆明碩擎生物科技有限公司純化并測(cè)序。運(yùn)用軟件Sequencher4.14對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析校正及拼接，并于NCBI中進(jìn)行比對(duì)，選取比對(duì)后相似序列，應(yīng)用MEGA6.06 軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，自展法檢測(cè)，自展數(shù)據(jù)集為1000次，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹中組群關(guān)系對(duì)菌株進(jìn)行分類。

1.6 分離率及多樣性指數(shù)

1.6.1 分離率與相對(duì)分離率 分離率[14]用來衡量石林石生真菌豐富度，指從分離得到的菌株數(shù)與全部樣本石塊數(shù)的比值；相對(duì)分離率用來衡量某種石生真菌的優(yōu)勢(shì)度，指分離到的某種石生真菌株數(shù)占分離到的總菌株數(shù)的百分率。

1.6.2 多樣性指數(shù)(H′)——Shannon-Weiner 指數(shù) Shannon-Weiner 指數(shù)[15]可以反映石生真菌的物種多樣性程度。按Shannon-Weiner 指數(shù)計(jì)算，若Shannon-Weiner指數(shù)數(shù)值越大，說明石林石生真菌的多樣性越高。其中,Pi表示某種真菌的相對(duì)分離率。

2 結(jié)果與分析

2.1 石生真菌分離結(jié)果

采用PDA培養(yǎng)基和MEA培養(yǎng)基從石林石漠化地區(qū)巖石中共分離得到68株石生真菌。2種培養(yǎng)基分離得到的菌株總數(shù)、分離率及種數(shù)見表1。2種培養(yǎng)基對(duì)石生真菌的分離效率差異較大。PDA 培養(yǎng)基分離石生真菌的效率較高，分離率達(dá)到115.00 %，種數(shù)為8；采用MEA培養(yǎng)基分離石生真菌，其分離率和種數(shù)，分別為55.00 %和4。

2.2 石生真菌形態(tài)鑒定

將分離的68株石生真菌根據(jù)菌落形態(tài)特征(圖2)、菌絲及孢子(表2)等顯微結(jié)構(gòu)特征初步鑒定為12 種形態(tài)型。初步判定SLT1為曲霉屬(Aspergillus)，SLT3為毛霉屬(Mucor)，SLT7、SLT9、SLT15和SLT25為鐮刀菌屬(Fusarium)，SLT8為青霉屬(Penicillium)，SLM2、SLM14為毛殼菌屬(Chaetomium)，其他菌株難以根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定，需通過分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定。

從石生真菌的分離比率(表2)可看出，68株石生真菌中，F(xiàn)usarium屬(SLT7、SLT9、SLT15和SLT25)、Chaetomium屬(SLM2、SLM14)、Aspergillus屬(SLT1)為優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)分離率分別為45.58 %、13.23 %、10.29 %；其他種群的分離比率均低于8.82 %。根據(jù)計(jì)算，PDA培養(yǎng)基分離到石生真菌的多樣性指數(shù)高于MEA培養(yǎng)基，分別為1.67995和0.73927。2種培養(yǎng)基分離得到的石生真菌多樣性指數(shù)為2.41922。顯示石林石生真菌具有豐富的多樣性。

圖2 部分石生真菌菌落形態(tài)Fig.2 Morphology of some rock-inhabiting fungi colonies

表2 石生真菌形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of rock-inhabiting fungi

2.3 石生真菌ITS序列PCR擴(kuò)增及序列分析

提取分離純化后的石生真菌DNA，檢測(cè)純度合格后采用引物ITS1(5’-CCGATGGTAACCTGCGG-3’)；ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進(jìn)行PCR，取4.0 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加上樣緩沖液混合，通過1.0 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增產(chǎn)物條帶均在600～700 bp左右(圖3)。

所得12株石生真菌rDNA -ITS序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較，以同源性最高序列作為參照菌株(表3)。所有真菌與數(shù)據(jù)庫中已知的真菌ITS序列相似度均在99 %～100 %。選取每種真菌GenBank數(shù)據(jù)庫中相似度最高的ITS參照序列，與獲得的12種真菌ITS序列一起，應(yīng)用MEGA6.06 軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，自展法檢測(cè)，自展數(shù)據(jù)集為1000次，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹中組群關(guān)系對(duì)菌株進(jìn)行分類(圖4)。

圖3 石生真菌ITS序列PCR電泳結(jié)果Fig.3 The results of PCR electrophoresis of rock-inhabiting fungi ITS sequences

表3 石生真菌GenBank登錄號(hào)及最大相似菌株Table 3 The rock-inhabiting fungi GeneBank accession number and the maximum similarity strain

系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示所分離得到的12種真菌除SLT3、SLT6屬接合菌門(Basidiomycota)外，其余均為子囊菌門(Ascomycota)，子囊菌門占優(yōu)勢(shì)地位，相對(duì)分離率為91.18 %。在5個(gè)真菌綱中，半知菌綱的真菌多樣性最高，有4種真菌，相對(duì)分離率為45.58 %。其余的菌株種類分別為散囊菌綱(2種)、接合菌綱(2種)、子囊菌綱(3種)和糞殼菌綱(1種)。

68株石生真菌分屬于2門5綱7目8科8屬12種，SLT1為黑曲霉(Aspergillusnigerstrain)；SLT3為尼迪科拉毛霉(Mucornidicolaisolate)；SLT6為高山被孢霉(Mortierellaalpinaisolate)；SLT7、SLT9、SLT15和SLT25均為鐮刀菌屬真菌(Fusarium)，SLT7為腐皮鐮刀菌(Fusariumsolanistrain)，SLT9為芬芳鐮刀菌(Fusariumsubglutinansstrain)，SLT15為磚紅鐮刀菌(Fusariumlateritiumstrain)，SLT25為水賊鐮刀菌(Fusariumchlamydosporumvar.fuscumstrain)；SLT8為嗜松青霉(Penicilliumpinophilumstrain)；SLM2、SLM14均為毛殼菌屬(Chaetomium)，SLM2為球毛殼菌(Chaetomiumglobosumisolate)，SLM14為黑毛毛殼菌(Chaetomiumnigricolorisolate)；SLM4為葡萄座腔菌(Dothiorellaviticola)；SLM5為糞生糞殼菌(Sordariamacrosporastrain)。

3 討 論

目前有關(guān)碳酸鹽巖及石漠化地區(qū)石生真菌的研究較少。形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)證據(jù)表明，大多數(shù)石生真菌屬于子囊菌門的座囊菌綱和散囊菌綱[16]。蘇磊[6]等對(duì)中國(guó)石生真菌的分類學(xué)與生態(tài)學(xué)的研究表明中國(guó)石生真菌的種類豐富，筆者在全國(guó)采集了348份巖石樣品，利用純培養(yǎng)技術(shù)分離出石生真菌1215株。通過多基因序列分析，并結(jié)合形態(tài)特征的鑒定獲石生真菌21屬，81種，隸屬于子囊菌門、盤菌亞門，座囊菌綱、散囊菌綱、星裂菌綱。唐源[17]等研究貴州南江大峽谷碳酸鹽巖表生微生物的多樣性，分離到17株碳酸鹽巖表生真菌，均屬于子囊菌門，為環(huán)境中較為常見的真菌。而對(duì)石林石漠化地區(qū)石生真菌的研究中采用PDA 培養(yǎng)基和MEA培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，共獲68株石生真菌。通過顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及rDNA-ITS基因序列觀察和分析，68株石生真菌歸于12個(gè)種。12種真菌中除SLT3、SLT6隸于接合菌門外，其余均為子囊菌門，相對(duì)分離率為91.18 %，為優(yōu)勢(shì)類群。

2 種培養(yǎng)基分離的石林石生真菌在數(shù)量和種類有較大差異。PDA 培養(yǎng)基分離石生真菌的效率較高，分離率達(dá)到115.00 %，種數(shù)為8，多樣性指數(shù)為1.67995；而MEA培養(yǎng)基分離石生真菌，分離率為55.00 %，種數(shù)為4，多樣性指數(shù)為0.73927。究其原因PDA培養(yǎng)基比MEA培養(yǎng)基含有更豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、微量元素等[18]，更適于石生真菌的生長(zhǎng)。利用不同培養(yǎng)基進(jìn)行分離的方法，獲得了更多的可培養(yǎng)石生真菌，為石漠化地區(qū)石生真菌多樣性的研究提供了豐富的菌種資源。

石生真菌只是石林表生微生物中的一部分，研究石林微生物的多樣性是一項(xiàng)綜合性的研究，這對(duì)改善石林環(huán)境，提高對(duì)喀斯特地貌的認(rèn)知具有重要意義。為全面了解微生物對(duì)喀斯特地貌的影響，對(duì)不同巖石表生微生物多樣性以及不同巖石表生微生物對(duì)巖石礦化及風(fēng)化的影響有待研究。

圖4 基于ITS序列鄰接法構(gòu)建的石生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of stone fungi based on ITS sequence neighboring method

采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法對(duì)石生真菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，不能分離出所有石生真菌。究其原因可能是沒有合適的培養(yǎng)基或者培養(yǎng)基的組成成分及培養(yǎng)條件較自然狀態(tài)下差異較大；還有對(duì)石生真菌生活的微小環(huán)境缺乏了解，不能準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)石生真菌的結(jié)構(gòu)組成。近年來，隨著宏基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，它克服了傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)的不足，直接提取DNA進(jìn)行微生物的群落組成和多樣性調(diào)查，為開發(fā)利用未培養(yǎng)微生物資源、發(fā)現(xiàn)新的基因提供了便利[19]，也給研究特殊環(huán)境中石生真菌的多樣性、群落組成和功能提供了新方法。這種方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用到土壤[20]、溫泉等環(huán)境的微生物多樣性研究中，但是目前未見有應(yīng)用宏基因組技術(shù)系統(tǒng)研究石漠化地區(qū)石生微生物多樣性的相關(guān)報(bào)道，課題組前期進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)巖石上微生物的DNA的提取難度較大，抽提的DNA樣品濃度達(dá)不到上機(jī)測(cè)序要求，有待研究。

中國(guó)石漠化地區(qū)分布廣闊，開展系統(tǒng)的石漠化地區(qū)石生微生物多樣性研究不僅能極大程度地豐富物種多樣性，而且對(duì)闡明石漠化區(qū)系石生微生物的起源、進(jìn)化以及如何參與形成石漠化地區(qū)特有景觀的機(jī)制具有重要意義。

4 結(jié) 論

從石林石漠化地區(qū)40份巖石樣品中，共分離得到68株石生真菌歸為12個(gè)種，隸于2門5綱7目8科8屬。12種真菌中除SLT3、SLT6隸于接合菌門外，其余均為子囊菌門，相對(duì)分離率為91.18 %，屬優(yōu)勢(shì)類群。在5個(gè)真菌綱中，半知菌綱的真菌多樣性最高，有4種真菌，相對(duì)分離率為45.58 %。其余的菌株種類分別為散囊菌綱(2種)、接合菌綱(2種)、子囊菌綱(3種)和糞殼菌綱(1種)。Fusarium屬(SLT7、SLT9、SLT15和SLT25)、Chaetomium屬(SLM2、SLM14)、Aspergillus屬(SLT1)為優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)分離率分別為45.58 %、13.23 %、10.29 %；其他種群的分離比率均低于8.82 %。

2種培養(yǎng)基分離的石林石生真菌在數(shù)量和種類上均有較大差異。PDA培養(yǎng)基分離石生真菌的效率較高，分離率達(dá)到115.00 %，種數(shù)為8，多樣性指數(shù)為1.67995；而MEA培養(yǎng)基分離石生真菌，分離率為55.00 %，種數(shù)為4，多樣性指數(shù)為0.73927。石生真菌多樣性指數(shù)為2.41922，上述結(jié)果顯示石林石生真菌多樣性豐富。