基于KASP技術(shù)的稻瘟病抗性基因Pi9分子標(biāo)記的開發(fā)與評(píng)價(jià)

韋 宇，李孝瓊，何新柳，陳紅操，陳 穎，黃克寧，盧東長城，郭嗣斌*

(1. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；2. 南寧維尓?jiǎng)P生物科技有限公司，廣西 南寧 530033；3. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西 南寧 530007)

【研究意義】水稻是世界上重要的糧食作物之一，全世界近50 %的人口以稻米為主食[1]。然而，由絲狀子囊真菌稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的水稻稻瘟病是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重影響稻米品質(zhì)及產(chǎn)量的主要病害之一，給糧食生產(chǎn)帶來重大損失，嚴(yán)重威脅世界糧食安全[2-3]。目前，稻瘟病的防治措施主要有噴施化學(xué)藥劑和選用抗稻瘟病品種，但是使用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治存在危害環(huán)境、增加農(nóng)業(yè)成本等問題。水稻生產(chǎn)實(shí)踐證明，防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的手段就是培育和種植抗稻瘟病水稻品種，而其中的關(guān)鍵則在于廣譜高抗的抗性基因資源的鑒定及發(fā)掘?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著水稻稻瘟病基因研究的不斷深入，很多與稻瘟病抗性基因相關(guān)的分子標(biāo)記相繼被開發(fā)出來。截至2017年，水稻中被報(bào)道的主效稻瘟病抗性基因超過100個(gè)[4]，其中已有27個(gè)稻瘟病抗性基因被成功克隆，如Pib[5]、Pb1[6]、Pita[7]、Pi9[8]、Pi2[9]、Pid2[10]、Pi36[11]、Pi37[12]、Pi56[13]及Pigm[14]等。學(xué)者們針對(duì)已克隆的抗稻瘟病基因開發(fā)出了特異性分子標(biāo)記，利用這些分子標(biāo)記不僅可以快速準(zhǔn)確地對(duì)水稻資源進(jìn)行鑒定，挖掘抗稻瘟病的種質(zhì)資源，還可以進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種，培育抗稻瘟病的育種新材料[15]。Pi9基因來源于小粒野生稻(Oryzaminuta)，具有廣譜抗性，對(duì)來自全世界各稻區(qū)的43份稻瘟病菌株都表現(xiàn)出較高的抗性[16-17]。目前在Pi9基因的分子標(biāo)記輔助育種上，普遍使用PB8標(biāo)記進(jìn)行，但該標(biāo)記為顯性標(biāo)記，不能鑒別稻株的基因型是雜合型還是純合型，只適合在育種早期進(jìn)行選擇[18]。另外，殷得所等[19]通過將含Pi9基因的“WHD75-1-127”株系與不含該基因的“揚(yáng)稻6號(hào)”以及“Nipponbare”中的Pi9基因進(jìn)行比較，根據(jù)序列差異設(shè)計(jì)了一個(gè)共顯性InDel標(biāo)記，為PB9-1標(biāo)記，但實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)抗病材料和感病材料之間只相差3 bp，必須用聚丙烯酰胺凝膠電泳才能檢測(cè)出來，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求較高，而且最后也難以區(qū)分純合體和雜合體。KASP(Kompetitive allele specific PCR)是競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR，是一種基于SNP的新型基因分型技術(shù)。KASP 技術(shù)具有穩(wěn)定性好和準(zhǔn)確性高、高通量，以及無需合成特異熒光探針，檢測(cè)成本較低等優(yōu)點(diǎn)，近年來得到快速的發(fā)展，目前已廣泛應(yīng)用于SNP高通量分型、InDels檢測(cè)等領(lǐng)域[20-21]，目前在水稻[22]、小麥[23-25]、卷心菜[26]以及大豆[27-29]等作物中得到廣泛的應(yīng)用。【本研究切入點(diǎn)】利用KASP技術(shù)開發(fā)Pi9基因熒光分子標(biāo)記，經(jīng)簡單的PCR擴(kuò)增和熒光掃描就能快速獲得基因分型結(jié)果，不需要經(jīng)過繁瑣的凝膠電泳分析，從而顯著提高檢測(cè)效率。因此，該標(biāo)記可以作為一種高通量的基因分型分子標(biāo)記?！緮M解決的關(guān)鍵問題】針對(duì)不同水稻材料中Pi9基因差異序列設(shè)計(jì)、開發(fā)可用于篩選具有廣譜抗稻瘟病基因Pi9的KASP分子標(biāo)記，通過分析比對(duì)水稻后代群體278份子代材料Pi9基因的Pi9-KASP基因型和SSR標(biāo)記基因型，并結(jié)合子代材料的稻瘟病抗性鑒定結(jié)果，驗(yàn)證該KASP標(biāo)記有效性。擬解決普通分子標(biāo)記過程中費(fèi)時(shí)費(fèi)力的問題，加速分子標(biāo)記輔助聚合優(yōu)異抗病基因及培育抗病新品種的進(jìn)程。

表1 供試材料Table 1 Tested material

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料包括供體親本“1205”，受體材料“58”、“91”、“1208”、“1209”、“1298”，以及供體親本分別與受體親本雜交、回交后衍生的5個(gè)后代群體71、72、79、80、81(表1)。供體材料“1205”是廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻所選育的攜帶廣譜稻瘟病抗性基因Pi9，且經(jīng)過田間抗性調(diào)查明確具有抗稻瘟病的品系。受體親本“58”、“91”、“1208”、“1209”、“1298”是由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所選育的，且經(jīng)田間抗性調(diào)查明確不抗稻瘟病的品系。

1.2 水稻葉片DNA提取

于2018年11月18日采集水稻幼苗期葉片，利用CTAB法快速提取基因組總DNA，使用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性。采用Thermo Fisher的Nanodrop 2000 分光光度計(jì)進(jìn)行DNA 濃度測(cè)定，將DNA 濃度調(diào)整到50 ng/μl。

Pi9-KASP分子標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)，其中重點(diǎn)突出部分為Pi9在各個(gè)株系中的SNP位點(diǎn)Primer design of Pi9-KASP molecular marker, the highlight of which is the SNP site of Pi9 in each strain圖1 Pi9基因中用于開發(fā)標(biāo)記的SNP位點(diǎn)及其引物設(shè)計(jì)Fig.1 SNP locus for the development of markers in the Pi9 gene and its primer design

表2 標(biāo)記引物序列Table 2 Sequence information of marker primers

1.3 KASP分子標(biāo)記的開發(fā)與利用

通過PCR克隆并測(cè)序分析，比對(duì)供體親本與受體親本之間的Pi9基因序列，獲得Pi9基因編碼區(qū)特異性SNP突變位點(diǎn)(圖1)，根據(jù)互補(bǔ)鏈SNP位點(diǎn)前后各60 bp的堿基序列設(shè)計(jì)了KASP分子標(biāo)記引物Pi9-KASP，包括1條正向通用引物和2條反向特異性引物(表2)。2條反向引物分別對(duì)應(yīng)FAM 和HEX 2 種熒光信號(hào)，F(xiàn)AM標(biāo)簽序列為GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，HEX標(biāo)簽序列為GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。Pi9-KASP 引物的設(shè)計(jì)和合成由LGC公司完成。

將提取的DNA稀釋5 ng/μl，分別加入96孔板中，配制反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。每個(gè)孔的PCR反應(yīng)體系總體積為10.14 μl，包括2×KASP Master mix 5 μl，KASP Primer mix 0.14 μl，模板DNA 5 μl。在ABI 7500 real-time PCR system上的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性20 s；61～55 ℃退火延伸60 s，10個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)降低0.6 ℃)；94 ℃變性20 s；55 ℃退火延伸60 s，26個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)檢測(cè)的2種熒光信號(hào)來判斷樣本分型情況，根據(jù)不同的熒光信號(hào)獲得不同的基因型(表3)。根據(jù)序列比較結(jié)果分析，預(yù)測(cè)PCR反應(yīng)后，Pi9基因擴(kuò)增一定可以檢測(cè)到FAM熒光信號(hào)，其他無Pi9基因的子代材料的等位基因擴(kuò)增可以檢測(cè)到HEX熒光信號(hào)，從而將Pi9在抗性品種的基因型與感病品種的基因型區(qū)分開。

1.4 SSR分析

PCR 反應(yīng)總體積為15 μl，其中DNA 模板2 μl，2×TaqPCR Master Mix 6 μl，10 nmol/L的正反向引物各0.5 μl，加ddH2O補(bǔ)足15 μl。稻瘟病抗性基因Pi9的特異性標(biāo)記M-Pi9的引物序列為：5’-GCTGTGCTCCAAATGAGGAT-3’， 5’-GCGATCTCACATC CTTTGCT-3’。

M-Pi9的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min 后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，循環(huán)條件為94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)結(jié)束后再72 ℃延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束后體系于4 ℃保存，M-Pi9的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入核酸染料，用濃度為2 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并記錄結(jié)果。陽性純合結(jié)果記為“+”，陰性純合結(jié)果記為“-”，雜合記為“3”。

表3 等位基因及其對(duì)應(yīng)熒光標(biāo)記Table 3 Corresponding relation of alleles and fluorescence marker

1.5 稻瘟病自然誘發(fā)抗性鑒定

自然誘發(fā)病圃設(shè)在稻瘟病多發(fā)區(qū)岑溪梨木鎮(zhèn)高圍村，面積約為0.7 hm2。病圃常年處于高溫、高濕的氣候環(huán)境中，具有利于發(fā)病的地理環(huán)境條件，歷年稻瘟病發(fā)生嚴(yán)重。病圃全生育期不噴殺菌劑，殺蟲劑的使用量根據(jù)病圃蟲害發(fā)生的程度而定。于2018年7月20日將5個(gè)分離群體種植于病圃，以桂井1號(hào)為感病對(duì)照。在成熟期，以桂井1號(hào)充分發(fā)病為準(zhǔn)，對(duì)供試材料進(jìn)行穗頸瘟調(diào)查。每個(gè)群體至少調(diào)查100株。田間的栽培管理、調(diào)查方法、病級(jí)劃分、記載標(biāo)準(zhǔn)和抗性評(píng)價(jià)按顏群等[30]的水稻品種試驗(yàn)抗性鑒定方法與標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。抗性類型：抗(抗性指數(shù)≤2.0)，中抗(2.1～4)，中感(4.1～6)，感(6.1～7.5)，高感(7.6～9)。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用 Pi9-KASP分子標(biāo)記對(duì)子代群體Pi9基因進(jìn)行檢測(cè)

利用設(shè)計(jì)的Pi9-KASP標(biāo)記對(duì)雜交群體中278個(gè)單株進(jìn)行基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)141個(gè)單株的基因型為T/T，137個(gè)單株的基因型為C/C(圖2，表4)。

2.2 利用SSR標(biāo)記對(duì)子代群體Pi9基因進(jìn)行檢測(cè)

以受體材料58的回交改良過程為例。在雜交后代選擇含Pi9抗性基因、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株進(jìn)行回交，利用Pi9基因內(nèi)的SSR標(biāo)記M-Pi9對(duì)雜交子代群體進(jìn)行檢測(cè)。在BC1F1群體中，共檢測(cè)了20個(gè)單株，其中有9個(gè)單株含Pi9雜合基因，部分檢測(cè)結(jié)果見圖2，其中1、2、3、4、5為含目標(biāo)基因的雜合體。分子標(biāo)記輔助篩選含Pi9抗性基因單株，經(jīng)過回交2次，自交2次，獲得BC2F3。2018年晚季大區(qū)種植BC2F4，在BC2F4群體中檢測(cè)子代群體的SSR標(biāo)記基因型，與Pi9-KASP分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，結(jié)果顯示Pi9-KASP分子標(biāo)記分型結(jié)果與SSR分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果一致(表4)。

利用Pi9-KASP對(duì)供體親本“1205”，受體親本“58”、“91”、“1208”、“1209”、“1298”，以及其雜交衍生群體Pi9等位基因的分型；圖中每個(gè)圓點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)樣品；藍(lán)點(diǎn)表示該樣品基因型為C/C，具有HEX標(biāo)簽序列；紅點(diǎn)表示該樣品基因型為T/T，具有FAM標(biāo)簽序列；×為空白對(duì)照(NTC)以及未檢出的樣品。以供體親本“1205”、受體親本(“58”、“91”、“1208”、“1209”、“1298”)，以及供體親本和受體親本的混合DNA作為陽性對(duì)照Genotyping of the donor parent ‘1205’, receptor parents ‘58’, ‘91’, ‘1208’, ‘1209’, ‘1298’ and their hybrid progeny population by Pi9-KASP; Each dot in the figure corresponds to a sample; The blue dot indicates that the sample genotype is C/C and has a HEX tag sequence; The red dot indicates that the sample genotype is T/T, and has a FAM tag sequence; ×represents NTC (Non-Template-control) and undetected samples. The DNA of the donor parent ‘1205’, the receptor parents (‘58’, ‘91’, ‘1208’, ‘1209’, ‘1298’), and the mixed DNA of the donor parent and the receptor parents were used as positive controls圖2 利用Pi9-KASP分子標(biāo)記對(duì)5個(gè)親本及衍生群體278個(gè)單株的基因分型檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Genotyping result of 5 rice germplasm and 278 individual plants of the derived population by using Pi9-KASP

表4 部分材料稻瘟病抗性及KASP分型、SSR標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果Table 4 Resistance of some materials against blast resistant and test results with KASP typing and SSR molecular markers

續(xù)表4 Continued table 4

編號(hào)NumberKASP分型KASPtypingSSR抗性Diseaseresistance編號(hào)NumberKASP分型KASPtypingSSR抗性Diseaseresistance71-3-2T/T+R79-2-4T/T+MR71-3-3T/T+R79-2-5T/T+R71-3-4T/T+R79-2-6T/T+R71-3-5T/T+R79-2-7T/T+R71-3-6T/T+R79-2-8T/T+MR71-3-7T/T+R79-2-9T/T+R71-3-8T/T+R79-3-1T/T+R72-1-1C/C-S79-3-2T/T+MR72-1-2C/C-S79-3-3T/T+R72-1-3C/C-HS79-3-4T/T+MR72-1-4C/C-HS79-3-5T/T+R72-1-5C/C-S79-3-6T/T+R72-1-7C/C-S79-3-7T/T+MR72-1-8C/C-HS79-3-8T/T+R72-1-9C/C-S79-3-9T/T+R72-2-1C/C-S79-3-10T/T+R

2.3 子代群體對(duì)稻瘟病的抗性表現(xiàn)

在岑溪稻瘟病鑒定點(diǎn)，2018年晚季感病對(duì)照桂井1號(hào)的穗瘟發(fā)病率均達(dá)100 %，病級(jí)達(dá)到7～9級(jí)，說明病圃發(fā)病條件充足，鑒定結(jié)果較可靠。對(duì)5個(gè)分離群體穗頸瘟的調(diào)查結(jié)果表明，含有Pi9基因的株系抗性基本都表現(xiàn)為抗(R)～中抗(MR)以上，抗級(jí)1～4級(jí)，平均為2.9級(jí)；不含Pi9基因的株系抗性均表現(xiàn)為感(S)～高感(HS)，抗級(jí)為6～9級(jí)，平均抗級(jí)為7.9，抗性鑒定結(jié)果與Pi9-KASP分子標(biāo)記分型結(jié)果及SSR分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果比較一致(表4)。

3 討 論

長期以來育種家們主要利用雜交、回交等常規(guī)育種技術(shù)結(jié)合人工接種或者自然感病的方式篩選新的抗性品種。然而，傳統(tǒng)方法的鑒定結(jié)果往往受到環(huán)境或人為因素的影響，而且稻瘟病菌的生理小種極易發(fā)生變異，導(dǎo)致了抗稻瘟病品種選育的難度大大增加，降低了抗病品種選育效率。利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)可以在群體的早世代時(shí)進(jìn)行稻瘟病抗性基因的檢測(cè)，提高育種效率及可靠性，加快育種進(jìn)程。前人研究結(jié)果表明，當(dāng)分子標(biāo)記與目的基因的遺傳距離小于5 cM時(shí)，選擇到含有目的基因的準(zhǔn)確率可達(dá)99.75 %[31]。Pi9基因已成功被部分育種研究者用于改良雜交水稻的稻瘟病抗性，如聶元元等[32]

M：分子量標(biāo)準(zhǔn)；P1：供體親本1205；P2：受體親本58；1～10：BC1F1單株M: DNA Marker；P1:Donor parent 1205； P2: Receptor parent 58；1-10: BC1F1 population圖3 引物M-Pi9對(duì)子代群體的單株篩選Fig.3 Screening of BC1F1 by primer M-Pi9

利用分子標(biāo)記輔助選擇方法，將抗稻瘟病基因Pi1、Pi2和Pi9成功導(dǎo)入到三系雜交稻恢復(fù)系“R225”中，其中含有1個(gè)或2個(gè)抗性基因的目標(biāo)株系的稻瘟病抗性均達(dá)到中抗水平以上；孫永建等[32]利用含Pi9基因的“C2”供體親本，通過常規(guī)育種及分子輔助選擇手段，獲得13個(gè)農(nóng)藝性狀優(yōu)良且抗性較好的改良新抗稻瘟病材料。

普通的Pi9分子標(biāo)記主要依賴于瓊脂糖電泳或PAGE 膠電泳分析，試驗(yàn)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而本研究利用KASP方法建立的Pi9熒光分子標(biāo)記不需要進(jìn)行電泳分析，3個(gè)96 孔板即可完成對(duì)本研究278份樣品的檢測(cè)，省時(shí)省力。本研究結(jié)果表明，該KASP標(biāo)記能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出水稻中Pi9基因?qū)?yīng)的熒光標(biāo)記，基因分型結(jié)果與SSR分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果一致，基因型與抗性表型也比較一致，可放心用于分子標(biāo)記輔助選擇育種中。鑒于KASP標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)具有穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高、檢測(cè)成本較低和高通量等優(yōu)點(diǎn)，借助KASP標(biāo)記，可以對(duì)大批量的樣品進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因分型，達(dá)到高通量進(jìn)行目標(biāo)基因驗(yàn)證和檢測(cè)的效果。

本研究中，利用KASP標(biāo)記和SSR標(biāo)記兩種方法對(duì)72群體的單株進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有單株均不含有Pi9基因，其抗性也表現(xiàn)為感或高感，這可能是由于該群體在之前選育過程中沒有用分子標(biāo)記跟蹤抗性基因而導(dǎo)致其丟失。因此，在選育過程中，在材料群體的早世代特別是分離世代，利用分子標(biāo)記跟蹤目標(biāo)基因，可以避免盲目性，提高育種效率及可靠性。

另外，在本研究中，含有Pi9基因的株系抗性基本都表現(xiàn)為抗(R)-中抗(MR)以上，不含Pi9基因的株系抗性均表現(xiàn)為感(S)或高感(HS)，這表明利用Pi9基因改造水稻稻瘟病抗性效果比較好。但由于自然界稻瘟病菌生理小種極易發(fā)生變異，導(dǎo)致水稻在不同環(huán)境下抗性不穩(wěn)定，因此，通過分子標(biāo)記方法將多個(gè)抗稻瘟病基因聚合到同一水稻品種中，是培育廣譜、持久抗稻瘟病品種的有效途徑。

4 結(jié) 論

KASP 標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)能夠快速、可靠地對(duì)水稻中抗稻瘟病基因Pi9進(jìn)行基因分型檢測(cè)，分型效率高。本研究開發(fā)的Pi9-KASP 標(biāo)記為利用Pi9基因進(jìn)行高效、可靠的分子標(biāo)記輔助選擇育種打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。