花生遠(yuǎn)緣雜交后代的氨基酸含量變異分析

彭振英，單 雷，張智猛，李新國(guó),4*，萬(wàn)書(shū)波

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心/山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2. 山東省花生研究所，山東 青島 266100； 3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100；4. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)作物栽培科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，山東 濟(jì)南 250100)

花生是我國(guó)三大油料作物之一，近年年種植面積500萬(wàn)hm2，年產(chǎn)超過(guò)1700萬(wàn)t，總產(chǎn)居油料作物之首，在保障我國(guó)食用油脂安全中具有舉足輕重的地位?；ㄉ粌H具有較高的含油量(50%左右)，其蛋白含量也很豐富[1]，而且抗早、耐瘠、適應(yīng)性廣、高產(chǎn)。在相同栽培條件下，其單位面積生產(chǎn)的蛋白量比大豆高2～3倍[2]。以山東省每年花生種植面積70萬(wàn)hm2、莢果產(chǎn)量4.5t/hm2計(jì)算，折合年產(chǎn)花生米220萬(wàn)t(按出米率70%計(jì))，折合蛋白(按蛋白含量28%計(jì))61.7萬(wàn)t。因此我國(guó)開(kāi)發(fā)利用花生蛋白的潛力很大。

一直以來(lái)，有關(guān)花生品質(zhì)方面的研究主要集中在油脂合成方面，并取得了一定的進(jìn)展[3-7]，而對(duì)花生蛋白方面的研究則很少[1]。欒文琪等人于1988年對(duì)379份山東省花生種質(zhì)的蛋白質(zhì)含量及氨基酸組分進(jìn)行了分析，結(jié)果表明花生籽仁蛋白質(zhì)含量平均為30.13%，在17種氨基酸中含量最高的為谷氨酸，平均為5.42%；其次為精氨酸、天冬氨酸和亮氨酸，最低的為蛋氨酸[1]。蘆春斌等人對(duì)兩種不同蛋白質(zhì)組成類型的花生種子的氨基酸成分進(jìn)行了比較，得到了類似結(jié)論，且認(rèn)為不同類型種子的氨基酸含量存在顯著差異[8]。上述分析表明，花生種子中存在17種氨基酸，但不同品種間氨基酸含量各不相同。

在花生種子發(fā)育過(guò)程中，脂類、蛋白和糖類三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝是相互關(guān)聯(lián)的，三者可以通過(guò)三羧酸循環(huán)相互轉(zhuǎn)化，因此無(wú)論研究哪個(gè)代謝途徑，都與其他二者密切相關(guān)。研究表明，花生種子中油脂含量與蛋白含量呈負(fù)相關(guān)[9]。栽培花生的遺傳多樣性較低，對(duì)少數(shù)種質(zhì)材料的過(guò)度利用使栽培花生的遺傳背景非常狹窄，適應(yīng)性降低。因此在目前狀態(tài)下，要通過(guò)常規(guī)雜交實(shí)現(xiàn)花生品種新突破，獲得高產(chǎn)、高抗、優(yōu)質(zhì)花生新品種是非常困難的。野生花生種質(zhì)資源十分豐富，具備許多栽培花生不具備的優(yōu)良性狀，如抗病性、抗逆性等。有的野生花生具有花多、花期長(zhǎng)、結(jié)果多、品質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值[10]。因此，挖掘野生花生的優(yōu)異基因資源，將這些新基因?qū)朐耘嗷ㄉ校貙捇ㄉ倪z傳背景，對(duì)于栽培種花生的遺傳改良具有重要意義。

利用黑花生(ArachishypogaeaL.)×A.monticola做雜交，獲得了一個(gè)高產(chǎn)花生株系(命名為YZJ-K6-81)，種子大小約為黑花生的2倍。利用桂花紅(A.hypogaeaL.)與A.monticola雜交，也獲得一個(gè)高產(chǎn)株系(YZJ-M41-95)，種子大小約為桂花紅的一半。本研究對(duì)這兩個(gè)雜種后代種子的氨基酸成分與含量進(jìn)行了檢測(cè)，以期為利用遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)制高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)花生新品種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2018年收獲的黑花生、桂花紅、YZJ-K6-81和YZJ-M41-95花生干種子。黑花生和桂花紅為普通花生品種，本實(shí)驗(yàn)室自存材料。黑花生株型直立，百仁重53.4 g。桂花紅株型直立，百仁重51.7 g。YZJ-K6-81為黑花生與A.monticola遠(yuǎn)緣雜交后代F4代材料，半匍匐型，百仁重92.8 g。YZJ-M41-95為桂花紅與A.monticola遠(yuǎn)緣雜交后代F4代材料，半匍匐型，百仁重25.0 g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水解氨基酸與游離氨基酸的測(cè)定

參照標(biāo)準(zhǔn)：中華人民共和國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。GB 5009.124-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定[11]。

1.2.2 氨基酸分析色譜條件

所用儀器為美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn)的液相色譜儀(型號(hào)：AG1100)。分析方法為OPA FMOC柱前衍生化法。色譜柱參數(shù)：(250×4.6)mm，5μm，ODS HYPERSIL。柱溫40℃。流速1.0 mL/min。紫外檢測(cè)器：338 nm，262 nm (Pro, Hypro)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解氨基酸類型與含量

從花生種子中總共能夠檢測(cè)到17種水解氨基酸(表1)。其中含量最高的是谷氨酸，其次是天冬氨酸和精氨酸，三者總和占水解總氨基酸含量的46.55%，其次是亮氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸，三者含量均超過(guò)1 g/100g。含量最低的是胱氨酸，含量?jī)H為0.1 g/100g左右。水解總氨基酸含量在這四個(gè)花生品種(系)差異較大，桂花紅含量最高，而YZJ-M41-95最低。

2.2 游離氨基酸類型和含量

從花生種子中總共能夠檢測(cè)到20種游離氨基酸(表2)。其中含量最高的仍然是谷氨酸，其次是苯丙氨酸和精氨酸，三者總和占游離總氨基酸的41.78%，接近一半。含量最低的是胱氨酸、色氨酸和組氨酸，三者含量均不到10mg/100g。游離總氨基酸含量在這四個(gè)花生品種(系)差異較大，黑花生含量最高而YZJ-K6-81最低。

表1 花生種子中水解氨基酸類型和含量 (g/100g干重)

注：表中數(shù)據(jù)為二次重復(fù)結(jié)果，同表2。

Note: Data in the table are result of two repeats. The same as table 2.

表2 花生種子中游離氨基酸的類型和含量 (mg/100g干重)

表3 四個(gè)花生品種(系)中水解氨基酸和游離氨基酸的變異系數(shù)分析

對(duì)比表1可以發(fā)現(xiàn)，花生種子中游離氨基酸的種類比水解氨基酸多3種，分別是色氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。色氨酸含量在花生種子中極低，僅4～6 mg/100g。谷氨酰胺和天冬酰胺的含量稍高，分別在15～34 mg/100g和35～50 mg/100g范圍之內(nèi)?；ㄉN子中游離氨基酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于水解氨基酸，游離氨基酸含量?jī)H為水解氨基酸含量的1.7%～3.2%，表明花生種子中絕大部分的氨基酸存在于蛋白質(zhì)和多肽中。

2.3 花生種子中氨基酸成分的變異分析

從表3可以看出，在17種水解氨基酸中，變異系數(shù)超過(guò)20的為脯氨酸和精氨酸；9種氨基酸的變異系數(shù)在15～20之間，5種氨基酸的變異系數(shù)在10～15之間；甲硫氨酸的變異系數(shù)最低，僅為5.696，顯示出甲硫氨酸含量在不同花生品種(系)中的穩(wěn)定性。

在20種游離氨基酸中，變異系數(shù)均較大(表3)。除天冬酰胺和色氨酸外，其余18種游離氨基酸含量的變異系數(shù)均超過(guò)20，其中5個(gè)超過(guò)40，苯丙氨酸和天冬氨酸含量的變異系數(shù)甚至超過(guò)50，反應(yīng)出游離氨基酸含量變化程度之大。但是，由于游離氨基酸所占比例較小，其變化對(duì)于整個(gè)花生種子中總氨基酸含量的變化來(lái)說(shuō)，影響不大。

2.4 遠(yuǎn)緣雜交后代與其親本之間水解氨基酸成分的變異分析

在水解氨基酸方面，黑花生與其雜種后代YZJ-K6-81的17種氨基酸以及總氨基酸含量基本相同(表1)，大部分氨基酸含量的變異系數(shù)都比較低，在0.08～3.00之間(表4)。只有5種氨基酸含量的變異系數(shù)大于3，最高的為胱氨酸，為10.87；其次是酪氨酸，為7.59；然后是甲硫氨酸、精氨酸和絲氨酸，分別為5.38、4.23和3.89。

而桂花紅與其雜種后代YZJ-M41-95的17種水解氨基酸與總氨基酸含量相差很大(表1)，YZJ-M41-95總氨基酸含量為19.12 g/100g干重，僅為桂花紅的66.2%。各種氨基酸含量的變異系數(shù)都較大(表4)，最低的是甲硫氨酸，為5.98；其次是胱氨酸，為11.83；其余氨基酸含量的變異系數(shù)均超過(guò)20，最大的為脯氨酸，變異系數(shù)達(dá)到37.58。這些結(jié)果表明，遠(yuǎn)緣雜交對(duì)其雜種后代氨基酸含量的影響因株系而異，有的株系遺傳穩(wěn)定性較高，而有的株系變異較大。

表4 遠(yuǎn)緣雜種后代與其親本的水解氨基酸變異系數(shù)分析

3 討 論

花生是我國(guó)重要的油料作物，2016年山東省花生莢果總產(chǎn)量達(dá)321.56萬(wàn)t[12]，可以折合花生油約112.3萬(wàn)t，蛋白質(zhì)約62.9萬(wàn)t，可見(jiàn)花生蛋白開(kāi)發(fā)利用的空間很大。但是到目前為止，有關(guān)花生蛋白合成的機(jī)理研究卻相對(duì)滯后。

我國(guó)花生以油用為主，50%以上用于榨油。從世界花生生產(chǎn)和利用的整體情況來(lái)看，全世界花生總量的近40%用于食用及食品工業(yè)，美國(guó)花生總量的70%以上用于食品工業(yè)。目前我國(guó)花生食品工業(yè)發(fā)展很快，對(duì)花生的食用品質(zhì)提出了新要求，主要表現(xiàn)在風(fēng)味品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)兩方面。風(fēng)味是人們通過(guò)視覺(jué)、嗅覺(jué)、味覺(jué)對(duì)花生產(chǎn)品的綜合評(píng)價(jià)。有人認(rèn)為，氨基酸和碳水化合物是炒花生風(fēng)味的前體物質(zhì)，天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、苯丙氨酸等都與炒花生的典型風(fēng)味有關(guān)[13]。花生的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，其能值為2.36 kJ/100g種仁。實(shí)驗(yàn)表明，用含16.7%花生蛋白的脫脂餅粕飼喂老鼠，老鼠的生長(zhǎng)速度與用12%～24%的酪蛋白飼喂效果相等[14]。但是花生蛋白質(zhì)中所含人體必須氨基酸距離優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)還有一定差距，特別是賴氨酸、色氨酸、蘇氨酸含量偏低。因此，食用花生品種的選育應(yīng)注意提高蛋白質(zhì)含量(30%左右)，對(duì)氨基酸成分方面也應(yīng)注意提高賴氨酸、色氨酸、蘇氨酸的含量。

目前為止，我國(guó)已選育出一批高蛋白花生品種，如泉紅花1號(hào)[15]、福花8號(hào)[16]、吉花19[17]、黔花生六號(hào)[18]等，蛋白質(zhì)含量均在30%以上。但是目前有關(guān)花生蛋白方面的研究也僅限于蛋白含量與水解氨基酸成分檢測(cè)[1,8]。本文通過(guò)對(duì)花生種子中水解氨基酸和游離氨基酸用液相色譜儀進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果與前人基本一致，水解氨基酸中以谷氨酸、天冬氨酸和亮氨酸含量較高，三者總和占水解總氨基酸含量的46.55%。花生種子中存在20種游離氨基酸，其中含量較高的是谷氨酸、苯丙氨酸和精氨酸，三者的總和占游離總氨基酸含量的41.78%。但是花生種子中的氨基酸絕大多數(shù)存在于蛋白質(zhì)和多肽中，游離氨基酸所占比例較小。

遠(yuǎn)緣雜交是創(chuàng)制花生新種質(zhì)的一種重要手段，我國(guó)利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)相繼培育出一批具有優(yōu)良性狀的花生品種[19-21]。本實(shí)驗(yàn)室利用野生花生與栽培品種雜交，獲得了一些具有優(yōu)良性狀的花生材料，如YZJ-K6-81和YZJ-M41-95，二者均具有高產(chǎn)的特點(diǎn)。試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，不同株系間氨基酸含量的變異系數(shù)有較大差異。黑花生與其雜種后代YZJ-K6-81的17種氨基酸以及總氨基酸含量差異均不明顯，而桂花紅與其雜種后代YZJ-M41-95的差異十分顯著，表明遠(yuǎn)緣雜交對(duì)其不同后代株系氨基酸含量的影響差異較大。與桂花紅相比，YZJ-M41-95總氨基酸含量為19.12 g/100g干重，僅為桂花紅的66.2%。已有研究表明，花生種子中油脂含量與蛋白含量呈負(fù)相關(guān)，蛋白質(zhì)含量與含油量占種子總重的80%左右, 一種成分的增加會(huì)伴隨著另一種成分的降低[9]。由此推測(cè)，YZJ-M41-95油脂含量會(huì)比桂花紅有顯著提高。因此，應(yīng)該把油脂合成與蛋白合成進(jìn)行聯(lián)合研究，才能對(duì)花生品質(zhì)性狀形成的遺傳基礎(chǔ)有更深入的了解。