miRNA-223在急性心肌梗死患者血清中的表達(dá)及其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響

韓明磊，金衛(wèi)東，劉振，王成，崔佳佳，李艷茹，王雪慧

急性心肌梗死（AMI）是冠狀動(dòng)脈（冠脈）疾病最嚴(yán)重的表現(xiàn)形式之一，是歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家致死率第三高的疾病[1]。缺血再灌注損傷會(huì)引起心肌細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基增多和心肌細(xì)胞鈣超載，加重心肌細(xì)胞凋亡和壞死，臨床表現(xiàn)為再灌注心律失常、心肌梗死面積擴(kuò)大及心功能惡化等[2]。因此，研究加重心肌細(xì)胞凋亡和壞死的分子機(jī)制，為心肌保護(hù)作用的藥物奠定理論基礎(chǔ)，進(jìn)而達(dá)到降低心肌梗死死亡率和并發(fā)癥發(fā)生率的臨床目的。

microRNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，通過(guò)對(duì)其靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控參與到調(diào)控細(xì)胞的生命活動(dòng)。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，microRNA的異常表達(dá)與癌癥[3-5]、心血管疾病[6-8]和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[9-11]等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Liu等[12]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，miR-223在AMI大鼠中高表達(dá)，并且敲低內(nèi)源性miR-223-3p可能是抗心律失常治療的新方法。但目前尚無(wú)研究報(bào)道m(xù)iR-223在AMI患者血清中的表達(dá)，以及其表達(dá)對(duì)人心肌細(xì)胞凋亡的影響。本文通過(guò)對(duì)比67例AMI患者和50例健康人群血清miR-223的表達(dá)水平，并以HCM細(xì)胞為模型探討miR-223表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與臨床資料隨機(jī)選取2015年1月至2017年1月于新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院血管內(nèi)科因胸悶胸痛收治，并確診為[7]AMI的患者67例為AMI組，其中男性40例，女性27例，年齡38～72歲，平均年齡（52.3±8.1）歲。同時(shí)隨機(jī)選取同時(shí)期在我院進(jìn)行體檢的健康人50例作為對(duì)照組（Control組），其中男28例，女22例，年齡42～73歲，平均年齡（53.9±6.7）歲。本次研究AMI組排除：①胸悶胸痛具體時(shí)間不詳，或者胸悶胸痛后超過(guò)12小時(shí)采血患者；②合并惡性腫瘤、肝腎功能不全或者HIV、乙肝等慢性感染性疾??；③入組前三月內(nèi)進(jìn)行過(guò)手術(shù)治療，或者入組前半年內(nèi)因病毒、真菌、細(xì)菌感染入院治療的患者；④體質(zhì)指數(shù)（BMI）＜18.5 kg/m2或者＞24 kg/m2；⑤治療過(guò)程中出現(xiàn)死亡；⑥年齡、性別或其他本次研究所需臨床資料不全的患者。此外，本次研究所有入組患者均對(duì)研究?jī)?nèi)容知情并簽訂知情同意書。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR向200 μl血漿加入1000 μl QIAzol裂解試劑（QIGEN，德國(guó)），靜置15 min，根據(jù)miRNeasy血清/血漿試劑盒（QIGEN，德國(guó)）中的方案提取RNA。使用適量的DEPC水來(lái)溶解總RNA。根據(jù)PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒（Takara，日本）合成cDNA.cDNA合成PCR參數(shù)設(shè)置：42℃ 15 min和85℃ 5 s。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM II（TakaRa，日本）制備20ul RT-qPCR反應(yīng)體系，并使用ABI 7500熒光定量PCR儀器（Applied Biosystems，USA）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR參數(shù)設(shè)置：95℃-30 s，90℃-5 s，65℃-30 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR引物：miR-223-F：5'-AC ACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3'，miR-223-R:5'-TGGTGTCGTGGATTCG-3'；U6-F:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA -3'，U6-R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；CCTN2-F：5'-GGAGTGGAGGCGGATAAAGAG-3'，CCTN2-R:5'-AGAGACATTGAGACGCTGTCC-3'；GAPDH-F：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，GAPDH-R：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATG G-3'。

1.3 臨床指標(biāo)的測(cè)定用EDTA收集外周血（5～10 ml），然后離心（1000×g）10 min（5810R，Eppendorf AG，德國(guó)）以收集血漿。用自動(dòng)生化分析儀（AU680，Beckman Coulter，USA）測(cè)定血漿采用全自動(dòng)生化分析儀（AU680，Beckman Coulter，USA）測(cè)定總膽固醇（TC），三酰甘油（TG），高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的血漿水平。

1.4 HCM細(xì)胞的培養(yǎng)與處理轉(zhuǎn)染前1 d將人心肌細(xì)胞（HCM）傳代（在轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞密度為70%-90%）。miRNA-223模擬物（5'-ACA GCAGGTGTCAGTTTGCAG-3'，Sangon Biotech（Shanghai）Co.，Ltd.）和陰性對(duì)照（5'-UUCUC CGAACGUGUCACGUTT-3'）使用Lip2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miRNA。轉(zhuǎn)染后6 h用正常培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后24 h用H2O2（終濃度50 μM）處理一組轉(zhuǎn)染細(xì)胞。再培養(yǎng)24 h后，分離并收集細(xì)胞。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集經(jīng)不同方式處理后的HCM細(xì)胞加入70%預(yù)冷乙醇（預(yù)冷PBS與無(wú)水依次配置）4度固定過(guò)夜，然后經(jīng)PBS清洗、PI處理后，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-30a-5p靶基因通過(guò)miRanda和PicTar等網(wǎng)站，并結(jié)合NCBI查找CCTN2基因3'-UTR與miR-223結(jié)合的部位，然后將這段3'-UTR的野生型（WT）和突變型（MUT）克隆到經(jīng)Sac I和Sal I雙酶切后的pmirGLO質(zhì)粒（addgene，美國(guó)）上，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒與miR-223-mimic或者miR-223-NC共轉(zhuǎn)到HCM細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞通過(guò)Dual-Luciferase系統(tǒng)（Promega，中國(guó)）檢測(cè)熒光素酶熒光強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法研究數(shù)據(jù)通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS 20.0進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分比形式表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。建立Logistic回歸模型以確定與AMI發(fā)病相關(guān)的假定危險(xiǎn)因素的優(yōu)勢(shì)比（OR）和95%置信區(qū)間（CI），以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象一般臨床資料比較對(duì)比50例健康人和67例AMI患者一般資料發(fā)現(xiàn)：兩組研究對(duì)象在年齡、性別、BMI以及是否吸煙上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在合并高血壓以及血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

2.2 miR-223在AMI患者血清中高表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于測(cè)定117例研究對(duì)象血清miR-223相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示：miR-223在67例AMI患者血清中的相對(duì)表達(dá)水平為（5.58±0.99），高于其在50例健康人血清（0.66±0.15）的相對(duì)表達(dá)水平（P＜0.05）（圖1）。

2.3 Logistic回歸分析以AMI（0=無(wú)，1=有）作為因變量，年齡、性別（0=女，1=男）、吸煙（0=是，1=否）、合并高血壓（0=否，1=是）以及連續(xù)變量BMI， TC，TC， HDL-C和LDL-C等作為獨(dú)立自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：miR-223是AMI發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（95%CI：0.859-0.251，P＜0.001）（表2）。

表1 50例健康人與67例AMI患者一般資料比較（x±s）

圖1 miR-223在AMI患者血清中高表達(dá)

2.4 miR-223靶向抑制CCTN2在HCM細(xì)胞中的表達(dá)通過(guò)miRanda和PicTar等網(wǎng)站，結(jié)合NCBI查找CCTN2基因3'-UTR與miR-223結(jié)合的部位（圖2A），熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)（圖2B）：在HCM細(xì)胞中，CCTN2是miR-223的靶點(diǎn)；通過(guò)向HCM細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-223-mimic可促進(jìn)miR-223在HCM細(xì)胞中的表達(dá)（圖2C），并抑制CCTN2基因在HCM細(xì)胞中的表達(dá)（圖2D-F）。

表2 AMI發(fā)病影響因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.5 miR-223高表達(dá)促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的HCM細(xì)胞凋亡H2O2是一種強(qiáng)氧化劑，加入到細(xì)胞的培養(yǎng)液中會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，本研究發(fā)現(xiàn)：在不加入雙氧水誘導(dǎo)的條件下，轉(zhuǎn)入miR-223-NC和轉(zhuǎn)入miR-223-mimic的HCM細(xì)胞都會(huì)由于轉(zhuǎn)入外源核酸而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但兩者對(duì)HCM細(xì)胞凋亡的影響情況無(wú)顯著差異（P＞0.05），但向兩者中均加入H2O2后，轉(zhuǎn)入miR-223-mimic的HCM細(xì)胞凋亡率高于miR-223-NC（P＜0.05）（圖3）。

圖2 miR-223靶向抑制HCM細(xì)胞表達(dá)CCTN2

圖3 miR-223高表達(dá)促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的HCM細(xì)胞凋亡

3 討論

MicroRNA是一類在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的、由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過(guò)對(duì)其靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控參與到真核細(xì)胞的分化、增殖、生長(zhǎng)和凋亡的調(diào)解[13]。在心血管疾病的中，miRNA不僅通過(guò)對(duì)其靶基因的調(diào)控而在心肌肥大、心肌壞死和凋亡中發(fā)揮著舉足輕重的作用，并且參與AMI發(fā)病的每個(gè)過(guò)程[14-16]。同時(shí)由于miRNA在血液中異常的穩(wěn)定，并且對(duì)各種病理生理?xiàng)l件下表達(dá)差異明顯，是一種理想的疾病血液檢測(cè)生物標(biāo)志物：Liu等[17]研究指出，血漿miR-1，miR-208和miR-499是漢族人群AMI的潛在預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。

本文研究發(fā)現(xiàn)，miR-223在67例AMI患者血清中的相對(duì)表達(dá)水平為（5.58±0.99），高于其在50例健康人血清（0.66±0.15）的相對(duì)表達(dá)水平（P＜0.05），并且經(jīng)Logistic回歸分析顯示miR-223是AMI發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（95%CI：0.859～0.251，P＜0.001）。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Liu等[12]發(fā)現(xiàn)miR-223-3p在進(jìn)行心肌梗死大鼠中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且高表達(dá)的miR-223-3p可以靶向抑制大鼠心室心肌細(xì)胞K+通道相關(guān)蛋白Kv4.2的表達(dá)，而miR-223-3p敲出大鼠可以有效的降低心律失常的發(fā)生率。結(jié)合本文我們的研究，我們可以肯定無(wú)論是在AMI動(dòng)物還是AMI患者，miR-223是高表達(dá)，并且高表達(dá)的miR-223可以通過(guò)對(duì)比靶基因表達(dá)的調(diào)控而參與到心肌細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)中。

miRNA哺乳動(dòng)物細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控主要是通過(guò)對(duì)其靶基因翻譯或者轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控來(lái)實(shí)驗(yàn)。miRNA識(shí)別并與靶標(biāo)基因3′UTR區(qū)部分配對(duì)，從而抑制靶標(biāo)基因的翻譯是miRNA對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的主要方式。本文通過(guò)miRanda和PicTar等網(wǎng)站，并結(jié)合NCBI查找CCNT2基因3'-UTR與miR-223結(jié)合的部位，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí)miR-223靶向抑制CCTN2的表達(dá)。CCNT2是由CCNT基因編碼的高度保守的細(xì)胞周期蛋白家族，作為CDK激酶的調(diào)節(jié)劑而對(duì)細(xì)胞周期的發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[18]。Ke等[18]研究中指出，miR-192可以通過(guò)靶向抑制CCNT2蛋白的表達(dá)而將人急性早幼粒白血病細(xì)胞阻滯在G0/G1期，進(jìn)而達(dá)到抑制其增殖和促進(jìn)其凋亡的目的。而miR-223是一種造血特異性microRNA，在骨髓譜系發(fā)育中具有關(guān)鍵功能，以為關(guān)于其的研究發(fā)現(xiàn)miR-223表達(dá)水平不僅可抑制急性淋巴細(xì)胞白血病患者造血細(xì)胞的增殖[19]，而且與肝局部缺血患者血清標(biāo)志物密切相關(guān)，并且指出肝臟缺血/再灌注損傷可能是另一種與miR-223表達(dá)改變相關(guān)的肝臟疾病。由此我們可以看出，miR-223可能通過(guò)對(duì)CCNT2蛋白的表達(dá)而對(duì)心肌梗死引起的心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響，而我們通過(guò)向HCM細(xì)胞中加入H2O2誘導(dǎo)其凋亡的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這點(diǎn)，即miR-223可以通過(guò)靶向抑制HCM細(xì)胞中CCNT2基因的表達(dá)而促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的HCM細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-223在AMI患者血清中高表達(dá)，并且高表達(dá)的miR-223可能通過(guò)靶向抑制心肌細(xì)胞CCTN2的表達(dá)而促進(jìn)其凋亡。