馬氏珠母貝TRADD基因克隆與組織表達(dá)分析

何軍軍，梁海鷹，陳 崧，房曉宸，黃雪敏

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馬氏珠母貝基因克隆與組織表達(dá)分析

何軍軍，梁海鷹，陳 崧，房曉宸，黃雪敏

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【目的】克隆馬氏珠母貝（）腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白（TRADD）基因，并分析其在各組織中的表達(dá)?！痉椒ā坷胏DNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)克隆獲得馬氏珠母貝基因的cDNA全長(zhǎng)序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）方法分析基因在馬氏珠母貝不同組織中的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果與結(jié)論】包含5′非編碼區(qū)101 bp，3′非編碼區(qū)144 bp和開放閱讀框（ORF）591 bp，編碼196個(gè)氨基酸。序列分析表明，PmTRADD沒(méi)有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，C端含有一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域（DEATH）。將PmTRADD死亡結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與其他物種的TRADD死亡結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同物種的TRADD死亡結(jié)構(gòu)域序列同源性較低。在馬氏珠母貝各組織中均有不同程度表達(dá)，在鰓組織中表達(dá)最高，肝胰腺次之，閉殼肌中基本無(wú)表達(dá)。

馬氏珠母貝; 腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白; 基因克隆; 實(shí)時(shí)熒光定量

馬氏珠母貝()最早發(fā)現(xiàn)于廣西合浦縣，其肉質(zhì)鮮美、所產(chǎn)珍珠具有非常高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。隨著珍珠養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展, 養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大, 種質(zhì)退化和病害問(wèn)題日趨嚴(yán)重, 海水珍珠產(chǎn)量和質(zhì)量顯著下降, 嚴(yán)重威脅我國(guó)海水珍珠產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展[2]。因此, 研究貝類免疫相關(guān)基因, 了解貝類免疫防御機(jī)制至關(guān)重要。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白 (tumor necrosis factor receptor associated death domain protein, TRADD) 是一種含死亡域 (death domain, DD) 的接頭蛋白, 是TNF受體-1（TNFR1）介導(dǎo)的TNF信號(hào)傳導(dǎo)的重要介質(zhì)，在TNFα介導(dǎo)的程序性細(xì)胞凋亡中至關(guān)重要[3]。TRADD蛋白含有功能未知的N末端區(qū)域和C末端死亡結(jié)構(gòu)域，與TNFR1的死亡結(jié)構(gòu)域有23% 的相同之處[4]。TRADD的過(guò)表達(dá)可激活TNFR1樣信號(hào)通路，用于細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活，在TNFR1應(yīng)答中發(fā)揮作用[5]。細(xì)胞凋亡在發(fā)育和免疫反應(yīng)中也起重要作用。在必要的情況下，生物體利用死亡信號(hào)消除威脅其存活的個(gè)體細(xì)胞，細(xì)胞因子如Fas配體和TNFα，可作為死亡信號(hào)與靶細(xì)胞表面的死亡受體結(jié)合，從而傳遞凋亡信號(hào)[6]，隨后TRADD與受體死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合并主要負(fù)責(zé)其它效應(yīng)蛋白的募集，如RIP1（受體相互作用蛋白1）、TRAF2（TNF受體-相關(guān)因子2）與TNFR1信號(hào)復(fù)合物、FADD（Fas相關(guān)蛋白與死亡域）對(duì)TNFR1誘導(dǎo)的二級(jí)復(fù)合物進(jìn)行招募[4-5,7-9]。這些銜接蛋白的募集導(dǎo)致MAP激酶和NF-κB的激活，也觸發(fā)其他信號(hào)通路，包括細(xì)胞死亡，促炎反應(yīng)等[8,10]。在日本腦炎病毒（JEV）實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)表明，神經(jīng)元中TNFR-1的表達(dá)模式在JEV感染后發(fā)生變化，并且是通過(guò)腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（TRADD）啟動(dòng)死亡級(jí)聯(lián)的[11-12]。此外，TRADD與TNFR1、TRAF的相互作用是通過(guò)其死亡結(jié)構(gòu)域與二者結(jié)合發(fā)生效應(yīng)，因此，TRADD可能同時(shí)結(jié)合TNFR1和TRAF，從而將TRAF募集到TNFR1復(fù)合物中[4]。

近年來(lái)，TRADD蛋白的很多研究主要集中在脊椎動(dòng)物的免疫功能中，例如在小鼠模型中TRADD的缺失對(duì)TAK1 / P38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)的影響機(jī)制，以及TRADD作為中樞銜接子，介導(dǎo)細(xì)胞死亡和炎癥信號(hào)[13-14]。盡管TRADD通常被認(rèn)為是細(xì)胞質(zhì)蛋白，但它也可能在細(xì)胞核中起作用[13]。TRADD還被證明是各種心臟損傷的重要保護(hù)因素，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激，缺血再灌注（I/R）損傷[15-16]。在軟體動(dòng)物中，細(xì)胞凋亡構(gòu)成一種重要免疫反應(yīng)，可以通過(guò)各種刺激引發(fā)，包括細(xì)胞因子，激素，毒性損傷，寄生蟲或病原體[17-19]。但目前為止，純粹的基因在軟體類研究未見報(bào)道，這也為馬氏珠母貝TRADD的研究增加了很大難度。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RACE技術(shù)獲得馬氏珠母貝基因的cDNA序列全長(zhǎng)并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，qRT-PCR技術(shù)研究其在馬氏珠母貝6個(gè)組織中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步了解在馬氏珠母貝中的免疫學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

養(yǎng)殖于廣東省湛江市徐聞縣的2齡馬氏珠母貝為實(shí)驗(yàn)用貝。取馬氏珠母貝閉殼肌、鰓、外套膜、肝胰腺、性腺和血淋巴6個(gè)組織作為本次實(shí)驗(yàn)材料，凍存于-80℃冰箱備用。

1.2 試劑

PrimeSTAR?Max?DNA?Polymerase、rTaq DNA聚合酶、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、Amp、克隆載體pMD-18T等購(gòu)自TAKARA公司，DEPC購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，RACE試劑盒購(gòu)自Clontech公司；Trizol和SYBR?Select Master Mix購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金公司。

1.3 方法

1.3.1 cDNA的合成

1.3.1.1 mRNA的提取 運(yùn)用Trizol法提取馬氏珠母貝閉殼肌等6個(gè)組織的總RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其完整性，Nano Drop ND1000紫外分光光度計(jì)測(cè)各組織RNA濃度并分析純度。5′RACE和3′RACE模板的制備參照SMARTRACE cDNA Amplification Kit（Clontech公司）的說(shuō)明書，實(shí)時(shí)熒光定量cDNA模板則參照Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）說(shuō)明書操作合成。

1.3.1.2 cDNA全長(zhǎng)序列的獲得 從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的馬氏珠母貝血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中獲得注釋為TRADD的unigene序列[20]，并設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。采用巢式PCR擴(kuò)增法進(jìn)行5和3末端的RACE擴(kuò)增，獲得5和3末端序列，多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增進(jìn)行中間片段驗(yàn)證。先通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，后根據(jù)純化回收試劑盒說(shuō)明書純化目的基因片段；回收目的基因片段導(dǎo)入到pMD-18T載體中，再轉(zhuǎn)化到Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，目的菌送生工生物工程(上海)股份有限公司分部廣州測(cè)序部測(cè)序。

表1 PmTRADD基因克隆及熒光定量所用的引物序列

1.3.2 生物信息學(xué)分析 使用DNAMAN軟件對(duì)已知的unigene序列和測(cè)序序列進(jìn)行重疊拼接，獲得基因的cDNA全長(zhǎng)序列。使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的ORF Finder （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）軟件預(yù)測(cè)該基因的開放閱讀框（ORF）并推導(dǎo)其氨基酸序列。使用Ex PASy-Prot Scale（http://web. expasy. org/protscale/）預(yù)測(cè)其疏水性，用Motif Scan（http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）搜索檢測(cè)序列功能位點(diǎn)，采用Signal P 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/）預(yù)測(cè)其信號(hào)肽，通過(guò)Ex PASy-Prot Param（http://web. expasy. org/prot-scale/）分析其理化性質(zhì)，SMART （http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi? NORMAL=1）預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)域。采用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_auto-mat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)Clustalw在線軟件進(jìn)行多序列比對(duì)；使用Mega 6軟件構(gòu)建生物系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.3 熒光定量檢測(cè)組織差異表達(dá) 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因在馬氏珠母貝閉殼肌、鰓、外套膜、肝胰腺、性腺、血淋巴6個(gè)組織中表達(dá)情況，作為內(nèi)參，每組樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，每個(gè)組織進(jìn)行4次生物學(xué)重復(fù)。各組織相對(duì)表達(dá)量用2-△△CT法計(jì)算。運(yùn)用SPSS 18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan’s多重比較對(duì)均值進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平= 0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 PmTRADD基因的cDNA克隆和序列分析

運(yùn)用RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得基因cDNA全長(zhǎng)為836 bp，其中5UTR為101 bp， 3UTR為144 bp，包含20 bp的poly A尾巴（圖1），ORF為591 bp，編碼196個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子量約為21.89 ku理論等電點(diǎn)為8.42。

2.2 PmTRADD蛋白理化性質(zhì)分析

PmTRADD蛋白的脂溶性系數(shù)（Aliphatic index）為54.29，不穩(wěn)定指數(shù)為63.04，屬于不穩(wěn)定蛋白?？偲骄H水性（Grand average of hydropathicity）為-0.721，屬于親水性蛋白（圖2），其中在第125位氨基酸達(dá)到最高親水性，親水指數(shù)為-2.322，在第180位氨基酸達(dá)到最高疏水性，疏水指數(shù)為1.556。PmTRADD不存在信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)域，表明該蛋白可能為非分泌蛋白。對(duì)PmTRADD序列進(jìn)行功能位點(diǎn)檢測(cè)可知，該蛋白有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，1個(gè)酰胺化位點(diǎn)，7個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，6個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)N-肉豆蔻酰化位點(diǎn)，3個(gè)微體C端靶向信號(hào)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白中α螺旋占41.84%，β轉(zhuǎn)角占3.06%，無(wú)規(guī)卷曲占45.41%，延伸鏈占9.69%。同時(shí)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示PmTRADD氨基酸序列在第99~196位有一個(gè)DEATH結(jié)構(gòu)域(圖3)。最后預(yù)測(cè)馬氏珠母貝PmTRADD蛋白分子的三維結(jié)構(gòu)（圖4)。

起始密碼子ATG和終止密碼子TAA用方框標(biāo)注; 陰影部分為DEATH結(jié)構(gòu)域

The initial codon ATG and the termination codon TAA are marked with the box; Shades of gray showed DEATH domain

圖1基因的核酸序列及編碼的氨基酸序列

Fig. 1 The nucleotide and amino acids sequences ofgene from

圖2 PmTRADD蛋白疏水性

圖3 SMART 軟件預(yù)測(cè)的PmTRADD蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

N: N末端; C: C末端(A: N-terminal; C: C-terminal)

2.3 多序列比對(duì)與進(jìn)化樹建立

運(yùn)用NCBI在線Blastx比對(duì)，結(jié)果顯示PmTRADD氨基酸序列與其它物種的相似性都較低。運(yùn)用CLUSTALW軟件將PmTRADD的死亡域（DD）氨基酸序列與智利鼠(, XP_004628516.1)、佛羅里達(dá)海牛(, XP_004387623.1)、海獺(, XP_022373460.1)、劍魚(, XP_023191591.1)、九帶犰狳(, XP_012376990.1)和文昌魚(, AEO79023.1)的TRADD死亡域（DD）氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果表明物種間TRADD的同源性不高，其中與文昌魚的同源性最高，同源性值為37.04%，與劍魚的同源性最低，同源性值為29.90%（圖5）。運(yùn)用MEGA 6軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建馬氏珠母貝氨基酸序列與原牛（, NP_001039361.1）、小鼠（, NP_001028333.1）、人類（, NP_001310481.1）、佛羅里達(dá)海牛(XP_004387623.1)、海獺(XP_022373460.1)、珍珠雞（, XP_021269726.1）、虹鱒魚（, NP_001118111.1）、北極紅點(diǎn)鮭（, XP_023858136.1）和銀鮭（, XP_020334958.1）的TRADD氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，顯示人類、原牛和小鼠這3類哺乳動(dòng)物聚為一簇，虹鱒魚、北極紅點(diǎn)鮭和銀鮭聚為一簇，并與哺乳類聚為一大支；佛羅里達(dá)海牛和海獺聚為一簇；而馬氏珠母貝單獨(dú)為一支，但是相對(duì)更靠近哺乳類。結(jié)果與傳統(tǒng)分類相吻合（圖6）。

“*”表示保守的氨基酸;“:”表示強(qiáng)相似的氨基酸;“.”表示弱相似的氨基酸

“*”indicate the conserved amino aicd;“:”indicate strong similar amino acid;“.”indicate weak similar amino acid

圖5 PmTRADD的死亡結(jié)構(gòu)域氨基酸序列多序列比對(duì)

Fig. 5 Multi-alignment of the DEATH domain of PmTRADD amino acid sequence

圖6 馬氏珠母貝TRADD蛋白質(zhì)序列聚類分析(Neighbor-Joining法)

2.4 PmTRADD組織差異表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在馬氏珠母貝閉殼肌等6個(gè)組織中的表達(dá)情況，2-△△CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)基因在各組織中均有表達(dá)，其中鰓組織表達(dá)量最高，其次是肝胰腺，在閉殼肌中基本不表達(dá)（圖7）。

A:閉殼肌; Gi:鰓; M:外套膜; He:肝胰腺; GO:性腺; B:血細(xì)胞;

相同小寫字母表示差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）

A: Adductor muscle; Gi: Gill; M: Mantle; He: Hepatopancreas; Go: Gonads; B: Hemocytes;Same lowercase letters indicate no statistically significant difference (> 0.05)

圖7組織表達(dá)分布

Fig. 7expression distribution in different tissues

3 討論

基因編碼的蛋白質(zhì)在C端存在一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域。含有這種結(jié)構(gòu)域的基因參與多種死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞正常凋亡中起重要作用。當(dāng)機(jī)體發(fā)出凋亡信號(hào)或其它刺激時(shí)，TRADD被腫瘤壞死因子招募并結(jié)合，參與細(xì)胞凋亡。TRADD的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致2種主要TNF誘導(dǎo)的反應(yīng)，細(xì)胞凋亡和NF-κB的激活，它們分別依賴于其與FADD 和TRAF2的特異性相互作用[21]。本實(shí)驗(yàn)利用RACE技術(shù)成功克隆出基因cDNA全長(zhǎng)。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PmTRADD無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明該蛋白可能為胞內(nèi)蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中發(fā)現(xiàn)TRADD主要以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)中也發(fā)現(xiàn)其含有5個(gè)α螺旋和1個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，由此可推測(cè)兩親性的α螺旋在TRADD蛋白的信號(hào)傳導(dǎo)和募集其它效應(yīng)分子的過(guò)程中扮演著主要功能。對(duì)其結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白第99~196位氨基酸形成特征性死亡結(jié)構(gòu)域。對(duì)死亡結(jié)構(gòu)域部分進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果表明物種間TRADD保守性較低，與其它6物種間的一致性為32.80%，其中與文昌魚相似性最高，為37.04%。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示馬氏珠母貝單獨(dú)聚為一支，與其它物種相離較遠(yuǎn)。軟體動(dòng)物中，基因的研究未見報(bào)道，但與其同源類基因相比較，在結(jié)構(gòu)上均含有DEATH結(jié)構(gòu)域，并且大多數(shù)DEATH結(jié)構(gòu)域都由100個(gè)左右氨基酸形成，例如在香港牡蠣()中克隆分析的4種腫瘤壞死因子死亡受體基因都含有這些特征[22]。本研究從基因角度探究貝類TRADD蛋白在進(jìn)化上是相對(duì)一致性，發(fā)現(xiàn)從軟體動(dòng)物到高等脊椎動(dòng)物，TRADD蛋白發(fā)生較大變異性。

為進(jìn)一步探討功能，檢測(cè)在馬氏珠母貝不同組織中表達(dá)量情況，發(fā)現(xiàn)其在所檢測(cè)組織中均有不同程度表達(dá)，在閉殼肌中基本無(wú)表達(dá)，在鰓中表達(dá)量最高，其次是肝胰腺。雖然在軟體動(dòng)物中未見TRADD更多報(bào)道，但在太平洋牡蠣()中發(fā)現(xiàn)的與TRADD緊密相關(guān)的TRAF2在鰓和肝胰腺中都有很高表達(dá)[23]；TRAF2作為TRADD蛋白的主要招募對(duì)象之一[4]，兩者在鰓和肝胰腺中共同的高表達(dá)現(xiàn)象，可猜測(cè)在細(xì)胞凋亡和其它免疫反應(yīng)中，TRADD能迅速招募TRAF2，并完成機(jī)能反應(yīng)。鰓與肝胰腺被認(rèn)為是貝類參與宿主對(duì)病原體的免疫防御反應(yīng)的主要免疫器官, 是機(jī)體受外界刺激，炎癥反應(yīng)和損傷后修復(fù)等的主要參與者[24-25]。在馬氏珠母貝鰓和肝胰腺中的高表達(dá)，說(shuō)明其可能在馬氏珠母貝細(xì)胞凋亡等免疫防御反應(yīng)中擔(dān)任著重要角色。本研究以馬氏珠母貝中基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)對(duì)其序列、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及表達(dá)進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究其在馬氏珠母貝免疫防御中的功能奠定基礎(chǔ)。

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Gene Cloning and Tissue Expression Analysis offrom

HE Jun-jun, LIANG Hai-ying, CHEN Song, FANG Xiao-chen, HUANG Xue-min

（,,524088,）

【Objective】To clone the tumor necrosis factor receptor associated death domain protein (TRADD) gene and analyze its expression patterns in tissues of.【Method】The full-length cDNA sequence ofwas cloned by rapid amplification of cDNA ends (RACE) and the expression of this gene was analyzed by RT-PCR.【Result and Conclusion】Thefull-length cDNA contained 5′ UTR (101 bp) , the 3′ UTR (144 bp) and open reading frame (591 bp) which encoded 196 amino acids. Analysis of deduced amino acids showed that it has no signal peptide and transmembrane domain, and the C-terminus contains a death domain (DEATH). Results from multi-sequence comparisons showed that the DEATH domain of PmTRADD has low homology compared with other species.gene was with higher expression level in the gill, followed by the hepatopancreas, and almost no expression in the adductor muscle.

;; Gene cloning; Real-time PCR

Q78；Q959.215

A

1673-9159（2019）04-0013-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.04.003

2019-04-12

國(guó)家自然科學(xué)基金（31472306）; 廣東省海港建設(shè)與漁業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（A201608B15）

何軍軍（1993－），男，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)無(wú)脊椎動(dòng)物增養(yǎng)殖和珍珠培育方向的研究。Email: 304458416@qq.com

梁海鷹（1971－），博士，教授。Email: zjlianghy@126.com

何軍軍，梁海鷹，陳崧，等. 馬氏珠母貝基因克隆與組織表達(dá)分析[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（4）：13-19.

（責(zé)任編輯：劉嶺）