支原體感染與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病相關(guān)性研究

李曉瑩 宋亞麗 陳臘梅 王盛華 路 麒

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種常見的系統(tǒng)性炎性自身免疫性疾病，具有較高的發(fā)病率、致殘率，其發(fā)病機制表現(xiàn)十分復(fù)雜，臨床醫(yī)學(xué)研究尚未完全明確，涉及抗原、趨化因子、一系列的免疫反應(yīng)、巨噬細(xì)胞及細(xì)胞因子等多種因素，最終造成軟骨、骨出現(xiàn)降解，進而導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、關(guān)節(jié)強直[1，2]。目前認(rèn)為未引起膿毒血癥的慢性感染與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎存在一定關(guān)聯(lián)性，其能作為誘因、病因造成類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病，或進一步加重病情，增加復(fù)發(fā)風(fēng)險[3]。支原體感染在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用逐漸受到關(guān)注，動物模型與患者關(guān)節(jié)液內(nèi)分離出支原體。但支原體的體外培養(yǎng)時間長、難度大，加之易受采樣及運送、保存、用藥等相關(guān)因素影響了研究結(jié)果[4]。基于此，本研究通過收集患者體液進行PCR檢查，探討支原體感染與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 入選標(biāo)準(zhǔn) 確診為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，患者及其家屬對本研究均知情，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并有嚴(yán)重的高血脂、高血壓、血栓性疾病、糖尿病、心腦血管疾病、血小板疾病及肝腎功能異常等疾??；②重疊其他類型風(fēng)濕病[5]；③并發(fā)惡性腫瘤；④合并沙眼衣原體感染或其他嚴(yán)重感染者。

1.2 一般資料 選取2017年1～12月期間在我院接受診治的120例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者作為研究對象，均符合入選標(biāo)準(zhǔn)。其中男57例，女63例，年齡40～52歲，平均(45.6±8.5)歲；病程1～12年，平均(5.2±2.3)年。

1.3 方法

1.3.1 采集標(biāo)本 所有患者入院接受診治時均采集咽拭子，并采集部分患者的尿道拭子(57例)、關(guān)節(jié)液(43例)、宮頸拭子(20例)標(biāo)本。(1)男性患者：從前尿道1～2 cm位置用無菌拭子取男性患者的尿道分泌物。(2)女性患者：采集患者宮頸分泌物，采集標(biāo)本時需先將宮頸口的多余黏液擦去，并于宮頸管內(nèi)1～2 cm位置用另一拭子取宮頸分泌物，采集過程中需在宮頸中旋轉(zhuǎn)，停留>20 s，便于獲取更多細(xì)胞。

采集標(biāo)本過程中需特別注意支原體對相關(guān)細(xì)胞表面存在很強的親和力，需盡量多采集細(xì)胞，采集標(biāo)本后需快速接種，避免在室溫、普通冰箱內(nèi)長時間保存，預(yù)防拭子干燥而導(dǎo)致支原體活力下降或死亡。

1.3.2 標(biāo)本處理 將采集的所有拭子標(biāo)本立即放入內(nèi)含無菌生理鹽水1～2 mL的潔凈試管內(nèi)進行振蕩、洗滌，并用移液器收取混懸液400 L后放入0.5 mL的離心管內(nèi)。而血液標(biāo)本，在吸取0.5 mL血清后放入0.5 mL的離心管內(nèi)，后經(jīng)15000 r/min離心5 min，將上清液吸棄，并加入裂解液(由0.5%的非離子去污劑配制成的400 g/L蛋白酶K溶液)，后開展55℃水浴1 h，再開展95℃水浴5 min。最后經(jīng)10000 r/min離心30 s，留取上清液，即為nPCR模板液[6]。

1.3.3 支原體檢測 所有標(biāo)本均用PCR方法檢測解脲脲原體(Uu)、關(guān)節(jié)炎支原體(Mar)、人型支原體(Mh)及發(fā)酵支原體(Mf)等，所有操作均參照說明書執(zhí)行。結(jié)合套式PCR產(chǎn)物應(yīng)用全自動熒光法分析DNA序列。

1.3.4 骨密度檢測 采用骨密度檢測儀對患者腰椎L2-4、左股骨頸骨密度進行檢測。

1.3.5 影像學(xué)檢查 采用X線等影像學(xué)方法對患者雙手及腕關(guān)節(jié)進行檢查，判斷關(guān)節(jié)破壞改變，根據(jù)關(guān)節(jié)破壞程度分成4期，I期：關(guān)節(jié)周圍的軟組織出現(xiàn)腫脹陰影，且關(guān)節(jié)端產(chǎn)生骨質(zhì)疏松；II期：關(guān)節(jié)間隙由于軟骨破壞而不斷狹窄；III期：關(guān)節(jié)面產(chǎn)生蟲鑿樣的破壞性改變；IV期：關(guān)節(jié)出現(xiàn)半脫位情況，且關(guān)節(jié)破壞后發(fā)生纖維性、骨性強直[7]。

1.4 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情評估 依據(jù)28個關(guān)節(jié)平均疾病活動性指數(shù)(DAS28)相關(guān)評分標(biāo)準(zhǔn)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病情活動性進行評估，包括觸痛關(guān)節(jié)數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)等內(nèi)容，總分0～10分，評分越高代表病情活動性越高[8]。

2 結(jié)果

2.1 支原體檢測情況 120例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者Uu、Mar、Mh及Mf檢測結(jié)果顯示，部分患者咽拭子、尿道拭子、關(guān)節(jié)液檢出支原體。見表1。

表1 120例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者支原體檢測陽性情況 n(%)

2.2 Uu陽性與陰性患者檢測結(jié)果 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中Uu陽性、陰性者骨密度減少或骨質(zhì)疏松、DAS3.2～5.1、DAS>5.1、影像學(xué)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 120例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中Uu陽性、陰性相關(guān)檢測結(jié)果比較 n(%)

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是常見的慢性、進行性炎癥疾病，其發(fā)病與細(xì)菌誘發(fā)因素的相關(guān)性是臨床關(guān)注重點之一，包括穿透支原體、逆轉(zhuǎn)錄病毒及發(fā)酵支原體等相關(guān)微生物[9,10]。支原體是指缺乏細(xì)胞壁的最小原核型微生物，結(jié)構(gòu)簡單，多數(shù)呈球形，沒有細(xì)胞壁[11]。解脲脲原體作為常見的支原體，屬于支原科目，是支原體科及脲原體屬之一[12]。依據(jù)分析生物學(xué)特征能分成2大生物群、14個血清型，其中生物1群主要包括1、36、14等較小的基因組，在支原體感染內(nèi)約占90.0%～92.0%[13]；而生物2群主要包括余下10個較大血清型基因組，在支原體感染內(nèi)約占8.0%～10.0%，由患者尿道分離獲取的主要表現(xiàn)為4型基因組[14]。目前，臨床醫(yī)學(xué)多認(rèn)為支原體致病性主要來源于細(xì)胞膜表面存在的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(LAMPs)，脂蛋白是其主要成分，存在良好的抗原性，能對宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答進行激發(fā)，且能與宿主細(xì)胞產(chǎn)生相互作用，研究發(fā)現(xiàn)支原體感染和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病存在相關(guān)性[15]。

本研究結(jié)果顯示，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的咽拭子、尿道拭子、關(guān)節(jié)液均檢出不同比例的支原體，其中Uu、Mh的檢出率高于Mar、Mf。說明支原體感染與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病存在一定相關(guān)性，分析支原體感染在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中可能起到輔助作用[16]。近年來，隨著臨床檢測、診斷醫(yī)學(xué)法發(fā)展，支原體生物學(xué)特征的深入研究顯示，不同支原體存在相同生物學(xué)特征，均可牢固的黏附于宿主細(xì)胞，能進入細(xì)胞而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[18]；且均能導(dǎo)致單核/巨核細(xì)胞、NK細(xì)胞及肺成纖維細(xì)胞的相關(guān)非特異性免疫釋放過量白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子-α、干擾素等相關(guān)細(xì)胞因子、一氧化氮。研究顯示，支原體等相關(guān)微生物能經(jīng)直接感染及間接交叉免疫反應(yīng)、超抗原、蛋白抗原等相關(guān)途徑產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中Uu陽性、陰性者在骨密度減少或骨質(zhì)疏松、DAS3.2-5.1、DAS>5.1、影像學(xué)II期方面存在一定差異；說明Uu感染和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病情活動存在相關(guān)性，同時Uu感染可能對成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的相關(guān)動態(tài)平衡造成破壞，對骨質(zhì)沉積造成不良影響。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎極大地影響患者的生活質(zhì)量，故對疾病活動性及發(fā)展進行評估是目前臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點[4]。DAS28是臨床評估類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情活動的綜合評估標(biāo)準(zhǔn)，其依據(jù)患者實驗室指標(biāo)、關(guān)節(jié)腫痛數(shù)，對疾病活動性進行客觀評價。本研究對入住患者的DAS28評分分析也進一步提示支原體感染與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情活動的相關(guān)性。Uu等多種支原體和人類具有共同抗原，且支原體能對人體免疫機能、細(xì)胞功能進行干擾。而滑膜組織內(nèi)高水平核因子kB受體活化因子配體能對破骨細(xì)胞凋亡進行抑制，增強受累關(guān)節(jié)破骨細(xì)胞分化，增加活性，將破骨細(xì)胞激活使骨組織脫鈣，并釋放一定組織蛋白酶使骨基質(zhì)蛋白降解，導(dǎo)致受累關(guān)節(jié)破壞進一步加重。但無法明確支原體感染在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中起到的作用是屬于激發(fā)者或是伴隨者，后面需增加樣本量進行深入性研究。

綜上所述，解脲脲原體等相關(guān)支原體感染在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病早期中起到重要作用，與患者關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞及關(guān)節(jié)功能障礙、生活質(zhì)量降低存在一定相關(guān)性，檢測支原體水平能從一定程度上評估類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情進展。