β連環(huán)蛋白在肝硬化大鼠心肌肥厚中的作用機(jī)制研究

方天富 王麗 郭寶亮

[摘 要] 目的 探討肝硬化大鼠心肌中的β連環(huán)蛋白（β-catenin）表達(dá)，以闡明β-catenin在肝硬化大鼠心肌肥厚中的作用機(jī)制。方法 建立肝硬化大鼠模型，通過模型組和對照組比較，免疫組化法檢測各組心肌組織中β-catenin表達(dá)水平;Western blot檢測大鼠心肌中的β-catenin和Wnt誘導(dǎo)的分泌型蛋白1（WISP-1）表達(dá)差異。結(jié)果 模型組體重增長較慢，且小于對照組。免疫組化及Western blot結(jié)果顯示對照組β-catenin蛋白的表達(dá)水平低，肝硬化模型組β-catenin蛋白的表達(dá)水平高，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 Wnt/β-catenin（Wnt/β-連環(huán)蛋白）信號(hào)通路參與肝硬化所致心肌肥厚的病理過程。

[關(guān)鍵詞] 肝硬化;SD大鼠;心肌肥厚;Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路

中圖分類號(hào)：R542.2;R575.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-816X（2019）03-0237-03

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.03.012

國內(nèi)外研究表明，在肝硬化患者中存在心肌異常，包括心肌肥厚、心肌細(xì)胞水腫、纖維化和滲出、細(xì)胞核空泡樣變性。肝硬化患者心肌肥厚多發(fā)生于肝硬化早期，組織形態(tài)學(xué)改變包括心肌肥大、細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)水腫、細(xì)胞損傷等，多表現(xiàn)為左心房心室肥大，左心室壁廣泛變厚，且對室間隔壁的影響超過游離壁。已有研究發(fā)現(xiàn)肝硬化患者冠心病的風(fēng)險(xiǎn)明顯增大[1]。早期肝硬化心肌?。╟irrhotic cardio myopathy，CCM）缺乏統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此目前缺乏有關(guān)CCM的流行病學(xué)數(shù)據(jù)[2]。

Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）信號(hào)通路近年備受關(guān)注，Wnt誘導(dǎo)的分泌型蛋白1（WISP-1）受Wnt/β-catenin水平的調(diào)控，WISP-1是一個(gè)促進(jìn)增生及纖維化的生長分子。Wnt/β-catenin信號(hào)通路除參與正常的生理過程外，還參與腫瘤發(fā)生和創(chuàng)傷修復(fù)過程，并在心臟發(fā)育過程中起雙重作用，其穩(wěn)定表達(dá)促進(jìn)早期心肌細(xì)胞的產(chǎn)生，而抑制其表達(dá)是發(fā)育晚期心肌細(xì)胞分化所必須的。本研究旨在探討肝硬化大鼠心肌中的β-catenin表達(dá)，以闡明Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肝硬化大鼠心肌肥厚中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器：SD雄性大鼠購自上海斯萊克有限公司，SCXK（滬）2017-0005，四氯化碳，茶油，β-catenin antibody一抗（abcam公司），二抗、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），蘇木素（Sigma公司），顯微鏡：BX43型（OLYMPUS公司）。

1.2 方法：

1.2.1 肝硬化模型的構(gòu)建：將23只SD大鼠隨機(jī)分為模型組（15只）與對照組（8只），模型組按0.20mL/100g劑量腹腔注射40%四氯化碳茶油溶液，每周2次，連續(xù)8周。對照組給予相同濃度的食用油溶液腹腔注射。模型組和對照組同時(shí)以10%乙醇溶液為其唯一飲用水源。

1.2.2 超聲心動(dòng)圖檢測：對各組大鼠使用超聲診斷儀進(jìn)行檢測，腹腔注射氯胺酮，將大鼠麻醉，胸部備皮后使用6-12MHz高頻線陣探頭每周經(jīng)胸骨旁左心室長軸切面及腹主動(dòng)脈的長軸切面連續(xù)檢測室間隔舒張末期厚度（IVSTd），左心室后壁舒張末期厚度（LVPWTd）及左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）。

1.2.3 免疫組化方法：至8周時(shí)，模型組隨機(jī)取材3只大鼠肝臟做HE染色，證實(shí)肝硬化大鼠模型復(fù)制成功后取各組大鼠心尖組織給予脫蠟、復(fù)水、孵育、沖洗。分別滴加一抗，二抗孵育過夜（設(shè)置PBS替代一抗作為陰性對照）后染色，干燥封片。置于顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選3個(gè)不同視野（×200）觀察，判讀陽性表達(dá)強(qiáng)度和陽性率。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）：剪切各組織于1.5離心管中，PBS洗一遍。收集細(xì)胞后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定其濃度。取50/lg蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，分別用一抗和二抗與膜進(jìn)行雜交反應(yīng)。電泳后采用化學(xué)光敏模式進(jìn)行曝光顯影。ID數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件（美國Bio-RAD公司）對Western印跡結(jié)果進(jìn)行定量分析，積分吸光度值（IA）表示灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS19.0版軟件，計(jì)量資料用（x -±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠體重比較：模型組體重增長較慢，且小于對照組（P<0.05），見圖1。

2.2 超聲心動(dòng)圖結(jié)果：造模后，模型組大鼠IVSTd，LVPWTd及LVDd與對照組比較均有顯著性變化，見表1。

2.3 HE染色結(jié)果：對照組心肌結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列規(guī)則;模型組心肌組織結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增大，部分心肌細(xì)胞肌絲溶解，有少量中性粒細(xì)胞浸潤，細(xì)胞壞死或空泡化，圖2見插頁。

2.4 β-catenin免疫組化結(jié)果：β-catenin呈褐色或黃褐色表達(dá)，主要存在細(xì)胞膜，部分表達(dá)于胞漿。結(jié)果顯示，β-catenin陽性表達(dá)模型組高于對照組，圖3見插頁。

2.5 Western blot結(jié)果：模型組β-catenin蛋白表達(dá)高于對照組，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖4。

3 討論

隨著大量研究表明，肝硬化患者存在外周血管阻力下降、動(dòng)脈壓降低，心率、血容量、心輸出量增加，這種高動(dòng)力狀態(tài)可由外周血管阻力下降、血容量分布異常、血管活動(dòng)物質(zhì)水平異常、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)紊亂引起，進(jìn)一步導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)異常。肝硬化患者心肌對刺激的反應(yīng)和心肌收縮力減弱，在應(yīng)激狀態(tài)下更為明顯，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致心力衰竭，該現(xiàn)象稱為肝硬化心肌?。–CM）。但是因肝硬化患者外周血管阻力減小，心臟后負(fù)荷顯著下降，從而掩蓋嚴(yán)重心功能衰竭表現(xiàn)，導(dǎo)致臨床表現(xiàn)隱匿[3]。

Wnt信號(hào)通路的主要成分包括：分泌蛋白Wnt家族，跨膜受體Frizzled家族，CK1，Deshevelled，GSK3，APC，Axin，β-catenin以及轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族。Wnt信號(hào)通路認(rèn)為它包括三個(gè)分支：經(jīng)典Wnt信號(hào)通路;Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路。Wnt信號(hào)途徑能引起細(xì)胞β-catenin積累。游離的β-catenin可進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

心臟對容量或壓力超負(fù)荷可表現(xiàn)出適應(yīng)性反應(yīng)，通常是心肌肥厚。研究表明，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)及RAS/RAF/MEK/ERK、RAF/NF-KB等信號(hào)傳導(dǎo)及體液因素是重要原因。Wnt信號(hào)水平的高表達(dá)在某些病理情況下對心肌重塑也發(fā)揮著重要作用[4，5]。β-catenin是一種多功能蛋白質(zhì)，作為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的第二信使，在肥厚因素刺激下，能引起心肌肥厚[6]。Baurand等[7]卻發(fā)現(xiàn)，在研究血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚的小鼠模型中，β-catenin基因敲除組的心肌肥厚較β-catenin穩(wěn)定表達(dá)組更顯著。

根據(jù)國內(nèi)外的研究，本文想到對于肝硬化患者是否Wnt信號(hào)通路在其引起的心肌肥厚病理變化中亦起重要作用。本研究表明兩組比較，模型組體重增長較慢，且小于對照組。免疫組化及Western blot結(jié)果顯示對照組β-catenin蛋白的表達(dá)水平低于模型組，二者比較有較顯著性差異（P<0.01）。β-catenin在肝硬化所致心肌肥厚的病理過程中發(fā)揮了一定的作用。

本研究顯示早期干預(yù)阻斷，可減輕肝硬化患者的心臟病理及生理改變，從而為廣大肝硬化患者的治療帶來更廣闊的前景。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2018-11-26）