丹酚酸B抑制肝纖維化-肝癌小鼠進展的信號通路研究

林雪茹 王福祥

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是起源于肝臟上皮或間葉組織的惡性腫瘤[1]，通常由慢性肝炎進展為肝纖維化(hepatic fibrosis)，再由肝纖維化進展為肝硬化(hepatocirrhosis)，最終演變成HCC?，F(xiàn)代研究已將中藥治療確定為HCC防治的重要研究方向之一[2]。近年來，丹參廣泛以應用于肝炎、肝硬化、HCC等肝病治療中，其有效水溶性成分丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)可有效抑制肝纖維化進展[3-4]，阻礙HCC發(fā)生。然而，丹酚酸B抑制肝纖維化-肝癌小鼠進展的相關機制尚不清楚?；诖?，本研究在二乙基亞硝胺誘導下建立肝纖維化-肝癌小鼠模型[5]，旨在探討Sal B對肝纖維化-肝癌小鼠的調控機制。

資料與方法

一、實驗動物

KM小鼠45只，SPF級，雄性，周齡6～8周，體質量為(18±22) g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可為SCXK(滬)2017-0005。

二、實驗方法

將小鼠隨機分為對照組、模型組、Sal B組，各組15只，適應性喂養(yǎng)1周后，模型組和Sal B組腹腔注射10 mL/kg 1.0%二乙基亞硝胺溶液(北京偶合科技有限公司)誘導肝纖維化-肝癌模型，對照組腹腔注射等量生理鹽水(廣州市益滿生物科技有限公司)，1次/周，連續(xù)16周。于造模當天開始，Sal B組給予20 mL/kg·d-1Sal B灌胃，對照組給予等量生理鹽水灌胃，持續(xù)灌胃至16周末。于肝纖維化期(12周末)處死小鼠4只，肝癌癌前病變期(16周末)處死小鼠5只，摘取肝組織備用，評價以下指標：①小鼠肝纖維化期和肝癌前階段的一般情況：包括精神狀態(tài)、毛發(fā)、飲食、活動、死亡率等。②小鼠肝纖維化期和肝癌前階段的肝臟指數：肝臟指數=(肝臟重量/體質量) ×100%。③肝組織情況：采用4%多聚甲醛溶液(上海江萊生物科技有限公司)固定肝組織，脫水，包埋，切為4 μm薄片，烤片，脫蠟，脫苯，沖洗，蘇木精-伊紅(HE)染色，梯度酒精(武漢梯度科技有限公司)脫水，二甲苯(深圳市吉達安科技有限公司)透明，中性樹脂(山東圣馬生物科技有限公司)封片，顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)。④采用Western Blot法檢測各組肝組織中pSmad3C、21、pSmad3L、pPAI-1蛋白表達：取小鼠肝組織，加RIPA裂解液，混勻，離心，提取總蛋白，上樣，電泳，轉至PVDF膜(Bio-Rad公司)上，25℃封閉1 h，加入兔抗PAI-1多克隆抗體、兔抗pSmad3C單克隆抗體(上海佑隆生物科技有限公司)、兔抗pSmad3L多克隆抗體(成都普思生物科技股份有限公司)、兔抗p21單克隆抗體(上海億欣生物科技有限公司)、兔抗GAPDH單克隆抗體(Abcam公司)，4℃孵育過夜，洗膜，加山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)室溫孵育90 min，PBST洗膜，曝光顯影，以GAPDH為內參蛋白，采用Image Quant TL軟件分析各條條帶的灰度值。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析比較組間計量資料(體質量、肝臟重量、肝臟指數)，P<0.05表示有統(tǒng)計學差異。

結 果

一、各組小鼠一般情況

對照組小鼠精神狀態(tài)良好，背毛柔順有光澤，飲食、活動、反應均正常，無一例死亡。模型組小鼠在肝纖維化期時精神較差、毛發(fā)光澤度差、飲食基本正常，活動量較少，處于肝癌癌前病變期時的小鼠精神萎靡、皮毛枯槁無光澤、飲食明顯異常，活動量明顯減少，捕捉無抵抗，死亡小鼠數為小鼠死亡率為40%(6/15)。Sal B組較模型組精神、毛發(fā)、飲食、活動、反應等方面的表現(xiàn)均有明顯改善，小鼠死亡率為20%(3/15)。

二、各組小鼠肝臟指數

肝纖維化期時，模型組及Sal B組肝臟指數較對照組顯著降低(P<0.05)，模型組肝臟指數較Sal B組差別不大(P>0.05)；肝癌癌前病變期時，模型組及Sal B組肝臟指數較對照組顯著降低(P<0.05)，Sal B組肝臟指數較模型組顯著升高(P<0.05)(表1)。

三、各組小鼠肝組織形態(tài)

對照組肝組織形態(tài)完整，邊緣銳利，色澤正常，表面光滑，質地柔軟有彈性，光鏡可見肝小葉結構完整，有匯管區(qū)，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，無變性壞死；肝纖維化期時，模型組肝組織表面粗糙，色澤異常，邊緣變鈍，光鏡可見胞質分解邊界模糊，肝細胞大量壞死，炎性細胞浸潤，大量膠原纖維分隔肝小葉形成假小葉結構；Sal B組表面較光滑，色澤明顯改善，質地較柔軟不易破裂，光鏡可見肝細胞壞死減少，炎細胞浸潤減少。肝癌癌前病變期時，模型組肝組織表面粗糙，質地堅硬易破裂，出現(xiàn)大量彌漫性結節(jié)，光鏡可見肝小葉結構紊亂，肝小葉內肝細胞大量壞死，肝細胞核體積變大，分裂相增多、異型性明顯，染色變深，出現(xiàn)明顯點狀出血點，大量淋巴細胞浸潤；Sal B組較模型組彌漫性結節(jié)變少，質地較柔軟，光鏡可見肝細胞壞死、炎細胞浸潤等有明顯改善(圖1、圖2)。

表1 各組小鼠肝臟指數比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

圖1 肝纖維化期時，各組肝組織形態(tài)學圖片 及HE染色結果(×100)

圖2 肝癌癌前病變期時，各組肝組織形態(tài)學圖片 及HE染色結果(×100)

四、各組小鼠肝組織中pSmad3C、p21、pSmad3L、PAI-1蛋白表達水平

模型組小鼠肝纖維化期時肝組織中p21、pSmad3L蛋白表達水平與對照組比較明顯上調(P<0.05)；模型組小鼠肝纖維化期時肝組織中pSmad3C蛋白表達與對照組比較無明顯變化(P>0.05)；Sal B組小鼠肝纖維化期時肝組織中pSmad3L、PAI-1蛋白表達水平與模型組比較明顯下調；Sal B組小鼠肝纖維化期時肝組織中pSmad3C、p21蛋白表達水平與模型組比較明顯上調(P<0.05)(圖3)。

模型組小鼠肝癌癌前病變期時肝組織中pSmad3C、p21、pSmad3L、PAI-1蛋白表達水平與對照組相比明顯上調(P<0.05)；Sal B組小鼠肝癌癌前病變期時肝組織中p21蛋白表達水平與模型組比較無明顯變化(P>0.05)；Sal B組小鼠肝癌癌前病變期時肝組織中pSmad3L、PAI-1蛋白表達水平與模型組比較明顯下調(P<0.05)；Sal B組小鼠肝癌癌前病變期時肝組織中pSmad3C蛋白表達水平與模型組比較明顯上調(P<0.05)(圖4)。

討 論

近年來，丹參及其復方制劑廣泛應用于抗肝纖維化中，具有良好療效，Sal B是其水溶性提取物之一。相關臨床研究證實, Sal B可抑制肝星狀細胞活化，減少膠原纖維(collagenous fiber)沉積，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用[6]。有研究報道Sal B可抗血吸蟲引發(fā)的肝纖維化，可下調血清中層黏連蛋白(laminin，LN)、IV型膠原(collegen type IV，C-IV)、總膽紅素(Total bilirubin，TBil)水平，且對乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B)肝纖維化患者無明顯毒副作用。另有文獻顯示[7]，Sal B可減輕CCl4、二乙基亞硝胺、TGF-β1等誘導的大鼠肝纖維化。二乙基亞硝胺是一種具有極強刺激氣味的N-亞硝基類物質，其可經過慢性肝炎-肝纖維化-肝硬化-肝癌過程誘導HCC發(fā)生。本實驗采用二乙基亞硝胺誘導小鼠肝纖維化-肝臟癌前病變模型，結果顯示模型小鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)生長、飲食活動等均異常，肝臟指數下降，小鼠死亡率上升；HE染色結果顯示，模型小鼠肝組織表面粗糙，肝細胞變性，出現(xiàn)彌漫性結節(jié)，膠原纖維增生，炎細胞浸潤，12周末出現(xiàn)假小葉結構，16周末增生肝細胞核異型性明顯。而Sal B組小鼠在肝纖維化期及肝癌癌前病變期的一般情況、體質量、肝臟重量、肝組織形態(tài)及肝細胞壞死現(xiàn)象、炎性細胞浸潤情況、細胞異型性等較模型組均有顯著改善。提示Sal B可抑制二乙基亞硝胺誘導小鼠肝纖維化-肝癌進展，對小鼠肝纖維化和HCC癌前病變有防治作用。近年有文獻報道[8]，TGF-β1 /Smad信號轉導通路在HCC病情進展中發(fā)揮不同效應，目前認為這種效應與Smad3不同位點磷酸化有關，其L-末端活化形式pSmad3L，靶向下游基因PAI-1，介導促進肝纖維化-肝癌信號，而其C-末端活化形式pSmad3C，靶向下游基因p21，介導抑制肝纖維化-肝癌信號。因此，我們推測Sal B可能通過干預 pSmad3C/pSmad3L而發(fā)揮抗肝纖維化-肝癌作用。本研究結果顯示，模型組p21、pSmad3L蛋白表達水平明顯高于對照組，Sal B組pSmad3C、p21蛋白表達水平明顯高于模型組，可能是Sal B通過TGF-β1/轉化生長因子β受體I(transforming growth factor β receptor I，TβRI)通路上調pSmad3C表達，激活其靶向下游p21蛋白表達，進而抑制肝纖維化肝纖維化-肝癌進展。Sal B組pSmad3L、PAI-1蛋白表達水平明顯低于模型組，分析其原因，Sal B可能通過TGF-β1/SAPK通路抑制pSmad3L表達，進而下調PAI-1表達，進而延緩肝纖維化-肝癌進展。

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

圖3肝纖維化期時，各組小鼠pSmad3C、pSmad3L、p21、PAI-1蛋白表達情況 A：對照組；B：模型組；C：Sal B組

圖4 肝癌癌前病變期時，各組小鼠pSmad3C、pSmad3L、p21、PAI-1蛋白表達情況 A：對照組；B：模型組；C：Sal B組

綜上，丹酚酸B可通過增強pSmad3C/p21介導的抑癌信號，減弱pSmad3L/PAI-1介導的促癌信號，阻礙小鼠肝纖維化-肝癌進展。