胃炎寧顆粒質(zhì)量標準研究

朱家紅 ，陳 贇 ，王影超，楊 勇 ，郭延紅，馮 勝

(1.貴陽護理職業(yè)學院，貴州 貴陽550081；2.貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004； 3.貴陽市第四人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

胃炎寧顆粒由檀香、木香(煨)、細辛、肉桂、赤小豆、雞內(nèi)金、甘草(蜜炙)、山楂、烏梅、薏苡仁(炒)十味藥材組成，具有溫中醒脾、和胃降逆、芳香化濁、消導化食的功效，臨床用于傷食濕重引起的胃脘痛、泛酸、惡心及消化不良的治療。目前，胃炎寧顆粒的質(zhì)量控制方法為國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的WS3-B-0774-91，僅有顯微鑒別及常規(guī)項目檢查。為更全面地控制胃炎寧顆粒的質(zhì)量，保證臨床用藥安全，本研究建立了該制劑中甘草和薏苡仁的薄層鑒別方法，以及甘草中甘草苷和甘草酸的含量測定方法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

薄層色譜自動點樣儀及照相系統(tǒng)(CAMAG ATS Ⅲ)；高效液相色譜儀(Thermo U3000和Agilent 1260 )；電子天平(METTLER TOLEDO)；超純水機(UPW-50N)；KQ-500DA型數(shù)控超聲波提取儀。

1.2 試劑與試藥

乙腈(色譜純，美國天地有限公司)；磷酸(色譜純，天津光復精細化工研究所，批號28080705)；石油醚(分析純，天津富宇細化工有限公司，批號20180415)；甲醇(分析純，天津富宇精細化工有限公司，批號：20180928)；其余試劑均為分析純。

甘草對照藥材(120904-201620)、薏苡仁對照藥材(121254-201203)、薏苡仁對照提取油(11750-201703)、甘草苷對照品(111610-201106以93.0%計)、甘草酸銨對照品(110731-201619以93.7%計)均由中國食品藥品檢定研究院提供。硅膠G板(安徽良臣硅源材料有限公司，批號：20170815)；胃炎寧顆粒樣品分別來自山東孔府制藥有限公司(20180403)、湖北老中醫(yī)制藥有限責任公司(20180415)、長春人民藥業(yè)集團有限公司(20180402)、吉林亞泰明星制藥有限公司(20180413)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 甘草薄層色譜鑒別[1-3]取樣品(批號為20180415)15 g，研細，加甲醇50 mL，超聲提取功率(100 kW)30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加水20 mL使其溶解，加乙醚30 mL振搖提取，棄去乙醚液，水液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，回收溶劑至干，殘渣加乙醇1 mL使其溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。取缺甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法，制得陰性對照溶液，按照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取上述溶液0.5～1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置于紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點，陰性樣品無干擾。見圖1。

1.陰性樣品；2.甘草對照藥材(120904-200512)；3.樣品(長春人民藥業(yè)集團有限公司，批號20180402)；4.樣品(湖北老中醫(yī)制藥有限責任公司，批號20180415)；5.樣品(吉林亞泰明星制藥有限公司，批號20180413)；6.樣品(山東孔府制藥有限公司，批號20180403)(紫外燈光365 nm下檢視，溫度21 ℃、相對濕度53%)

圖1 甘草薄層色譜

2.1.2 薏苡仁薄層色譜鑒別[1，4-7]取樣品(批號為20180415)10 g， 研細，加石油醚(60～90 ℃)50 mL，超聲提取(100 kW)30 min，濾過，濾液濃縮至3 mL，作為供試品溶液，另取薏苡仁對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取薏苡仁油對照提取物，加石油醚(60～90 ℃)制成1 mL含2 mg對照藥材的溶液，作為對照提取物溶液。取缺薏苡仁的陰性樣品，按供試品溶液制備方法，制備陰性對照溶液，按照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取供試品溶液5 μL、對照藥材和對照提取物溶液各1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙醚-冰醋酸(8∶2∶0.1)為展開溶液展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品提取物色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品無干擾。見圖2。

1.陰性樣品；2.薏苡仁對照藥材(121254-201203)；3.薏苡仁對照品提取物(11750-201703)；4.樣品(長春人民藥業(yè)集團有限公司，批號20180402)；5.樣品(湖北老中醫(yī)制藥有限責任公司，批號20180415)；6.樣品(吉林亞泰明星制藥有限公司，批號20180413)；7.樣品(山東孔府制藥有限公司，批號20180403)。(日光下檢視，室溫20 ℃，相對濕度20%)

圖2 薏苡仁薄層色譜

2.2 甘草含量測定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Waters XBridge C18色譜柱(4.6 mn×250 mm，5 μm)，流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液，梯度洗脫程序見表1。檢測波長：273 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃。理論塔板數(shù)按甘草苷計應不低于5 000。

表1 二元梯度洗脫程序 (%)

2.2.2 溶液制備 ①供試品溶液：取胃炎寧顆粒(批號：20180415)適量，研細，取0.25 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲提取(100 Kw)20 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得；②取缺甘草藥材的陰性樣品，制備陰性對照品溶液；③對照品溶液：精密稱定甘草苷(2.707 mg)、甘草酸銨對照品(3.493 mg)，分別置于不同容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，制成每1 mL含上述2種成分依次為0.253 6、0.324 8 mg的單一對照品貯備液。

2.2.3 方法學考察 (1)專屬性試驗。取“2.2.2”項下3種溶液，按照擬定的色譜條件進樣，記錄色譜峰。結(jié)果供試品溶液和對照品溶液在相同保留時間處有色譜峰，陰性樣品無干擾，且分離度較好，表明方法專屬性好。詳見圖 3。

1.甘草苷；2.甘草酸 A.對照品溶液；B.樣品溶液；C.陰性對照品溶液

(2)線性關(guān)系考察。精密量取“2.2.2”項下對照品貯備液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，依次進樣1 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL；再精密量取上述對照品貯備液各1 mL，置于同一2 mL量瓶中，搖勻。 進樣量10 μL，按上述色譜條件分別進樣測定，以進樣量(X)為橫坐標，峰面積為(Y)縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)(見表2)。結(jié)果表明，2種成分在各自的濃度范圍內(nèi)與峰面積積分線性關(guān)系良好。

表2 兩種指標成分的線性關(guān)系和范圍

(3)精密度考察。精密吸取甘草苷(0.253 6 mg/mL)、甘草酸銨(0.318 3 mg/mL)的對照品混合溶液10 μL，重復進樣6次，結(jié)果甘草苷峰面積RSD為0.56%(n=6)，甘草酸峰面積RSD為0.11%(n=6)，表明儀器精密度良好。

(4)重復性試驗。取同一批(批號為20180415)樣品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，按擬定色譜條件測定，結(jié)果甘草苷與甘草酸的平均含量分別為0.309 5 mg/g、0.374 9 mg/g，RSD分別為1.17%(n=6)、1.06%(n=6)，表明方法重復性良好。

(5)穩(wěn)定性試驗。取同一批供試品溶液(批號為20180415)，分別于放置0、4、8、10、13、21、24 h時進樣，測定甘草苷的峰面積，結(jié)果RSD為 0.669 8%(n=6)；測定甘草酸的峰面積，結(jié)果RSD為0.358 2%(n=6)。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

(6)加樣回收試驗。取樣品(批號為20180415，甘草苷含量為0.386 9 mg/g，甘草酸含量為0.468 6 mg/g)6份，精密稱定，每份0.25 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甘草苷(0.384 076 3 mg)和甘草酸銨(0.475 95 mg)的混合對照品溶液 25 mL，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表3。

表3 甘草苷和甘草酸加樣回收試驗結(jié)果 (n=6)

(7)樣品測定。按照“2.2.1”項下色譜條件，分別測定4批樣品，結(jié)果見表4。

表4 不同廠家胃炎寧顆粒中甘草苷和甘草酸含量 (mg/袋)

3 討論

3.1 定性鑒別

參考《中國藥典》及有關(guān)文獻，方中烏梅、山楂的主要成分均為枸櫞酸[1]，無法確定專屬性，目前國內(nèi)也沒有相應研究，故不選擇這兩種進行研究。根據(jù)工藝方法得知檀香、木香(煨)細辛、肉桂的有效成分均為揮發(fā)油，曾測得木香的主要成分木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯含量太低，考察認為在方中揮發(fā)油藥材占比低，且在生產(chǎn)中損失比較大，故不選擇木香作為研究對象。

甘草薄層板：考察了2015版《中國藥典》甘草的薄層板，即1%氫氧化鈉的硅膠G板，分離效果不好，故改用硅膠G板，分離效果好，斑點清晰。

薏苡仁展開劑選擇：以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-醋酸(10∶3∶0.1)為展開劑展開，Rf值小，分離效果不好，故選擇石油醚(60～90 ℃)-乙醚-冰醋酸(10∶2∶0.1)為展開劑，陰性樣品無干擾，分離效果好。

薏苡仁的觀察條件選擇：參考2015版《中國藥典》薏苡仁的薄層鑒別，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點清晰，使用以后斑點不明顯，故選擇10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱，置于紫外燈(365 nm)下檢視，斑點清晰，分離度好，無干擾。

3.2 含量測定

提取溶劑與方法：根據(jù)甘草苷、甘草酸的理化特性，選擇甲醇、乙醇、70%乙醇為提取溶劑，超聲提取，以70%乙醇提取效率最高，雜質(zhì)對主峰無干擾，峰型對稱，故本實驗選擇70%乙醇為提取溶劑。再對70%乙醇超聲提取和回流提取的效率進行考察，結(jié)果顯示，兩種提取方式效率無明顯差異，且超聲提取操作簡單，故最終選擇超聲提取。

提取溫度與時間：考察了提取時間對提取效率的影響，結(jié)果顯示，提取時間超過 20 min時提取效率變化不明顯，故選擇超聲 20 min 提取。

流動相及檢測波長：曾參考文獻[2]采用乙腈-0.017 mol/L磷酸水溶液-三乙胺( 35∶65∶0.3) 作為流動相測定甘草酸銨( 實際測得峰是甘草酸的峰，再按系數(shù)折算成甘草酸銨，即甘草酸銨的量=甘草酸的量×1.020 7) ，結(jié)果未出峰，原因是流動相偏堿性，甘草酸銨無法水解成甘草酸，故最終選擇乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)為流動相，梯度洗脫(0 min時82%B，8 min時82%B，35 min時50%B，36 min時0%B，45 min時82%B )。本試驗中選擇 273 nm 為甘草苷與甘草酸銨的檢測波長。