不同提取工藝對制何首烏含量的影響研究

董 鑫，左亞妹，李 敏，曹建軍

(亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，山西 運城 044600)

何首烏為蓼科植物何首烏PolygonummultijiorumThunb.的干燥塊根，具有解毒、消癰、潤腸通便之功效，主要活性成分包含蒽醌類、二苯乙烯苷類、黃酮類、磷脂類等[1，2]。制何首烏為何首烏經(jīng)黑豆汁制后的炮制加工品，具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、化濁降脂等功效[3，4]。其中，2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(簡稱二苯乙烯苷，TSG)是何首烏最具代表的特征性成分，有降低膽固醇、增強(qiáng)免疫、抗骨質(zhì)疏松、保肝等功效[5]，已被 2015 年版《中國藥典》作為何首烏質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。在工業(yè)化大生產(chǎn)中，提取、干燥方式的不同，工藝參數(shù)控制情況，都會影響制何首烏中二苯乙烯苷的含量；為盡可能減少二苯乙烯苷的破壞，提高含量，本研究采用不同的提取及干燥方式得制何首烏干膏粉，以二苯乙烯苷為指標(biāo)，進(jìn)行了含量測定，以確定最佳的提取工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 儀器與藥品

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；RE 52-99 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-3200DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(塞多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

二苯乙烯苷(中國食品藥品檢定研究院，110844-201411，含量，93.2%)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher 公司)；磷酸二氫鉀(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

制何首烏藥材由亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司購買自安徽易元堂中藥飲片科技有限公司(批號：20170101，含量，以2.3.5.4’-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D葡萄糖苷(C20H22O9)計，2.21%；批號：20170301，含量，以2.3.5.4’-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D葡萄糖苷(C20H22O9)計，2.03%；批號：20170501，含量，以2.3.5.4’-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D葡萄糖苷(C20H22O9)計，2.09%)，均經(jīng)質(zhì)檢科鑒定復(fù)核。

2 方法與結(jié)果

2.1 制何首烏提取方法

2.1.1 70%乙醇提取 制何首烏藥材破碎，每份稱取300 g。加70%乙醇回流提取3次，每次加4倍量，提取時間分別為2 h、1 h、1 h，合并提取液，過濾，減壓濃縮回收乙醇，得浸膏1(相對密度1.00～1.10)，備用，平行制備3份。

2.1.2 水提醇沉 參照安神補腦膠囊國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)，制何首烏藥材破碎，每份稱取300 g。加飲用水煎煮兩次，每次加12倍量，每次2 h，合并提取液，過濾，減壓濃縮至相對密度為1.25～1.32(50 ℃)的浸膏，放涼至室溫后緩緩加入乙醇，使含醇量達(dá)到50～55%，攪勻，靜置24 h，過濾，濾液回收乙醇，濃縮至原浸膏量。放涼至室溫后緩緩加入乙醇，使上述浸膏含醇量至60%～65%，靜置24 h，過濾，濾液回收乙醇，得浸膏2(相對密度1.00～1.10)，備用，平行制備3份。

2.2 制何首烏干燥方法

將上述所得浸膏1，浸膏2，各取100 g，分別采用真空干燥箱(60～75 ℃，0.04～0.08 MPa，12～24 h)和微波干燥(30～40 ℃，60～70 min)進(jìn)行干燥，粉碎，得干膏粉。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5μm)；流速：1.0 mL·min-1；流動相：乙腈(A)-0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(B)(25∶75)；檢測波長：320 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；理論板數(shù)按2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰計算大于5 000。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品12.5 mg，置50 mL 棕色容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置50 mL 棕色容量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，配成濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取干膏粉約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加三氯甲烷50 mL，超聲處理(功率250 W，頻率25 kHz)20 min，濾過，棄去濾液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙一同放回具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，精密稱量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，以稀乙醇補足減失的重量，取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按“2.3.1”項下色譜條件，分別吸取“2.3.2”項下標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積。回歸方程為：Y=752.8X+2.363，R2=0.999 6，結(jié)果表明二苯乙烯苷濃度為10～50 μg/mL時，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見圖1、圖2和表1。

圖1 二苯乙烯苷對照品色譜

圖2 制何首烏干膏粉色譜

濃度積分回歸方程R2濃度范圍10μg/mL20μg/mL30μg/mL40μg/mL50μg/mL755.231 510.442 265.652 996.873 776.21Y=752.8X+2.3630.999610～50μg/mL

2.3.5 精密度檢驗 按“2.3.1”項下色譜條件，吸取對照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，二苯乙烯苷峰面積的RSD為0.28%，精密度好。

2.3.6 重復(fù)性檢驗 取同一干膏粉樣品6份，分別按照“2.3.3”項條件制成供試品溶液，按“2.3.1”項色譜條件測定，結(jié)果顯示，6份樣品的二苯乙烯苷峰面積的RSD為1.47%，重復(fù)性好。

2.3.7 穩(wěn)定性檢驗 取一干膏粉樣品，按照“2.3.3”項條件制成供試品溶液，放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.3.1”項色譜條件測定，結(jié)果顯示，二苯乙烯苷峰面積的RSD為1.02%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率實驗 取已知含量的干膏粉樣品6份，精密稱定，添加對照品溶液2 mL，平均回收率為99.7%，RSD為1.86%，表明此方法回收率良好。

2.4 不同提取方式的浸膏得率

計算不同提取方式所得浸膏的浸膏得率，70%乙醇提取浸膏得率明顯高于水提醇沉，P<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)差異。見表2。

提取方式浸膏得率(%)70%乙醇25.64±0.08*水提醇沉15.21±0.75

注：與水提醇沉相比，*P<0.05。

2.5 不同提取及干燥方式對含量的影響

分別對不同提取方式所得浸膏，進(jìn)行含量測定，結(jié)果顯示，水提醇沉浸膏含量為(1.80±0.46)%，70%乙醇提取所得浸膏含量為(0.87±0.10)%；水提醇沉略優(yōu)于70%乙醇，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。

分別對不同干燥方式所得干膏粉中的二苯乙烯苷進(jìn)行含量測定，結(jié)果顯示，微波干燥所得干膏粉含量明顯高于減壓干燥，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

名稱烘干方式含量測量值(%)含量(%)P水提醇沉干膏粉微波干燥(n=3)減壓干燥(n=3)11.289.028.595.644.125.349.63±1.45*5.03±0.800.01770%乙醇干膏粉微波干燥(n=3)減壓干燥(n=3)7.166.975.233.133.114.326.45±1.06*3.52±0.690.028

注：與減壓干燥相比，*P<0.05。

3 結(jié)語

有文獻(xiàn)報道[5]，何首烏在炮制過程中，化學(xué)成分和藥理作用都發(fā)生了明顯的改變，藥效也隨之改變。何首烏經(jīng)炮制后，二苯乙烯苷的含量低于生何首烏[6]，且隨炮制時間延長和溫度升高而降低。

本實驗結(jié)果表明，70%乙醇提取浸膏得率明顯高于水提醇沉，含量略低于水提醇沉，70%乙醇提取更適于工業(yè)化生產(chǎn)。微波干燥所得干膏粉含量明顯高于減壓干燥(P<0.05)；實驗過程中，減壓干燥溫度60～75 ℃，時間12～24 h，受熱時間較長，溫度較高，而微波干燥受熱時間和溫度都明顯低于減壓干燥，故含量較高。

在實際生產(chǎn)中，因70%乙醇提取工序簡單，浸膏得率較高，含量略低于水提醇沉，而微波干燥可以減少二苯乙烯苷的損失，故建議在工業(yè)化生產(chǎn)中采用70%乙醇對制何首烏進(jìn)行提取，采用微波干燥法進(jìn)行烘干，并嚴(yán)格控制干燥溫度、時間等參數(shù)，可滿足生產(chǎn)需求。