超高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定腎復(fù)康合劑中落新婦苷和蘆丁的含量

魏秀麗丁新仁徐恩民?欒明娜李有志孫亞磊張傳津

（1．山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南250022；2．山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250022；3．山東齊發(fā)藥業(yè)有限公司，濟(jì)南250400；4．青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，山東青島266000）

腎復(fù)康合劑由土茯苓、槐花、白茅根、益母草、廣藿香等中藥經(jīng)提取加工所制成的口服液體制劑，本處方來(lái)源于中華人民共和國(guó)藥典2015年版一部“腎復(fù)康膠囊”，具有清熱利尿、益腎化濁的功能［1］。經(jīng)過(guò)提取工藝參數(shù)的優(yōu)化、藥學(xué)藥效、靶動(dòng)物雞安全性及穩(wěn)定性試驗(yàn)等的研究，開(kāi)發(fā)成一種新獸藥合劑，主成分土茯苓具有解毒除濕通利關(guān)節(jié)的作用，槐花具有涼血止血之妙，在中獸醫(yī)臨床上用于防治由雞大腸桿菌病、雞傳染性法氏囊病、雞傳染性支氣管炎、雞病毒性腎炎或中毒、營(yíng)養(yǎng)代謝障礙等引起的雞腎腫濕熱證，經(jīng)臨床試驗(yàn)證實(shí)在靶動(dòng)物雞上兌水飲用［2］，安全有效經(jīng)濟(jì)方便。以往常常采用普通高效液相色譜方法檢測(cè)土茯苓和槐花主成分中落新婦苷和蘆丁的含量［3-6］，時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果慢。本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)了超高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定腎復(fù)康合劑中落新婦苷和蘆丁的含量，快速可行，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。

1 材料與方法

1．1 藥品及試劑 落新婦苷（批號(hào)111574-201404，20 mg，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；蘆?。ㄅ?hào)111868-201401，20 mg，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。甲酸、甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；超純水。腎復(fù)康合劑，批號(hào)20150601，青島蔚藍(lán)生物股份有限公司小試生產(chǎn)產(chǎn)品。

1．2 儀器 分析天平：感量0．00001 g；儀器Waters AcquityTM Ultra performance LC 超高效液相色譜儀；Aglient1260 高效液相色譜儀。

1．3 方法

1．3．1 供試品溶液制備 精密量取本品0．5～1．0 mL，加60%甲醇稀釋至50 mL，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1．3．2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備 精密稱(chēng)取落新婦苷10．03 mg，加60%甲醇至10 mL，精密稱(chēng)取蘆丁9．98 mg，加60%甲醇至10 mL。

1．3．3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用60%甲醇稀釋?zhuān)苽涑上盗袧舛葹椋郝湫聥D苷2、5、10、25、50、75 μg／mL，蘆丁4、10、20、50、100、150 μg／mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1．3．4 色譜操作條件及參數(shù) 色譜柱：ACQUITY UPLCTM C18 色譜柱（2．1mm×100 mm，1．7 μm）；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：0．1%甲酸溶液，進(jìn)行梯度洗脫；流速：0．35 mL／min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：35 ℃，進(jìn)樣室溫度10 ℃。二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為204 nm。液相色譜梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Table of gradient eluting conditions

1．3．5 重復(fù)性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn) 配制50 μg／mL落新婦苷100 μg／mL 蘆丁對(duì)照品溶液，重復(fù)配置6 份，進(jìn)樣，計(jì)算落新婦苷、蘆丁峰面積RSD。配制50 μg／mL 落新婦苷100 μg／mL 蘆丁對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算落新婦苷、蘆丁峰面積RSD。

1．3．6 檢測(cè)限和定量限的測(cè)定 對(duì)落新婦苷和蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行UPLC 的分析，并逐級(jí)降低其濃度，以溶液檢測(cè)時(shí)的信噪比（S／N）分別大于等于3 和10 作為藥物的檢測(cè)限和定量限。

1．3．7 不同色譜條件樣品檢測(cè)比較 使用普通的液相色譜儀和超高效液相色譜儀在不同的色譜條件下運(yùn)行，對(duì)同一合劑樣品中兩主成分落新婦苷和蘆丁的含量、檢測(cè)波長(zhǎng)和出峰時(shí)間分別進(jìn)行比較。

1．3．8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 進(jìn)樣室溫度設(shè)置到10 ℃。取1．3．5 項(xiàng)下50 μg／mL 落新婦苷100 μg／mL 蘆丁溶液，在10 ℃放置3、6、12、24 h；各進(jìn)樣2 μL，計(jì)算落新婦苷、蘆丁峰面積RSD。

1．3．9 回收率的測(cè)定 精密稱(chēng)定已知含量（原有量）的同一批合劑樣品0．5 mL 共6 份，加入落新婦苷儲(chǔ)備液1．0 mL 和蘆丁儲(chǔ)備溶液2．5 mL，按供試品溶液制備方法分別制備供試品溶液50 mL，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，計(jì)算落新婦苷和蘆丁的回收率和RSD。

1．3．10 色譜柱耐受性 本實(shí)驗(yàn)選擇了35 ℃流速0．34、0．35、0．36 mL／min 測(cè)試色譜柱保留時(shí)間的耐受性。并選擇流速0．35 mL／min 保持不變，柱溫35、38、40 ℃進(jìn)樣，測(cè)試色譜柱的耐受性。

2 結(jié)果與分析

2．1 色譜分離 在優(yōu)化的色譜條件下，測(cè)得落新婦苷和蘆丁色譜峰峰形良好，且均達(dá)到基線(xiàn)分離，滿(mǎn)足分離度要求。

2．2 線(xiàn)性 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可以有效地分離目的峰，落新婦苷在2～75 μg／mL 的范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y＝88300x+77000，Y為落新婦苷峰面積，X為落新婦苷的濃度，其相關(guān)系數(shù)R2大于0．998，線(xiàn)性良好；蘆丁在4～150 μg／mL 的范 圍 內(nèi) 標(biāo)準(zhǔn) 曲 線(xiàn) 為y＝43800x+126000，Y為蘆丁峰面積，X為蘆丁的濃度，其相關(guān)系數(shù)R2大于0．996，線(xiàn)性良好。

2．3 重復(fù)性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn) 配制50 μg／mL落新婦苷100 μg／mL 蘆丁對(duì)照品溶液，重復(fù)6 份，進(jìn)樣，計(jì)算落新婦苷、蘆丁峰面積RSD分別為0．63%、0．59%，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。取50 μg／mL 落新婦苷100 μg／mL 蘆丁對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算落新婦苷、蘆丁峰面積RSD為0．23%、0．26%，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。

2．4 檢測(cè)限和定量限 1 μg／mL 落新婦苷2 μg／mL蘆丁對(duì)照品溶液信噪比＞3 為檢出限，2 μg／mL 落新婦苷4 μg／mL 蘆丁對(duì)照品溶液信噪比＞10 為定量限。

2．5 不同色譜條件樣品檢測(cè)結(jié)果比較 對(duì)同一合劑樣品中兩主成分落新婦苷和蘆丁的含量、檢測(cè)波長(zhǎng)和出峰時(shí)間分別進(jìn)行了比較，結(jié)果如表2所示。

表2 不同色譜條件檢測(cè)結(jié)果表（n=6）Tab 2 Test results at different chromatographic parameter （n=6）

高效液相色譜運(yùn)行條件按照中華人民共和國(guó)藥典方法進(jìn)行［1］。由于兩種色譜方法均已通過(guò)其方法學(xué)驗(yàn)證，均可以準(zhǔn)確控制其指標(biāo)成分。從檢測(cè)效率上看，優(yōu)選超高效法（UPLC）色譜圖見(jiàn)圖1～圖2。普通色譜法采用了雙波長(zhǎng)檢測(cè)落新婦苷和蘆丁的含量，色譜圖見(jiàn)圖3～圖4。

2．6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 落新婦苷、蘆丁峰面積RSD為0．47%、0．58%，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。

2．7 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 落新婦苷和蘆丁的平均回收率為98．33%和97．14%，RSD分別為0．88%和1．18% （表3～表4）。

圖1 75 μg／mL 落新婦苷150 μg／mL 蘆丁對(duì)照品溶液色譜圖（204 nm）Fig 1 Chromatogram of reference solution of 75μg／mL astilbin and 150μg／mL rutin at 204 nm

圖2 腎復(fù)康合劑樣品色譜圖204 nmFig 2 chromatogram of Shenfukang mixture sample at 204 nm

圖3 高效液相色譜法 對(duì)照品色譜圖Fig 3 chromatogram of reference standard by HPLC

圖4 高效液相色譜法 腎復(fù)康合劑色譜圖Fig 4 Chromatogram of Shenfukang mixture by HPLC

表3 落新婦苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Test results of recovery rate of astilbin

表4 蘆丁加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 test results of Recovery of rutin

2．8 色譜柱耐受性 本實(shí)驗(yàn)選擇了35 ℃流速0．34、0．35、0．36 mL／min 進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)試，保留時(shí)間如表5所示，流動(dòng)相流速的微小變化對(duì)保留時(shí)間影響不大，最終選擇0．35 mL／min。

本實(shí)驗(yàn)選擇流速0．35 mL／min 保持不變，35、38、40 ℃下進(jìn)樣測(cè)試，保留時(shí)間如表6所示，分離度均滿(mǎn)足要求。考慮到色譜柱的耐受性，最終選擇35 ℃。

表5 不同流速主成分保留時(shí)間表Tab 5 Retention time of principal components at different flow rate

表6 不同柱溫主成分保留時(shí)間表Tab 6 Retention time of principal components at different column temperatures

3 討論與結(jié)論

3．1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 蘆丁、落新婦苷對(duì)照品和腎復(fù)康合劑樣品待測(cè)液，在2．1 項(xiàng)條件下，色譜保留時(shí)間為4．884、5．760 min 左右，分離度均滿(mǎn)足要求（圖1～圖2、圖5～圖8）。光譜圖如圖9所示。由色譜圖和光譜圖可以看出對(duì)照品和樣品中，257 nm落新婦苷響應(yīng)值很低，291 nm 蘆丁響應(yīng)值較低，定量波長(zhǎng)為顧及兩者相應(yīng)值都高，定為204 nm（204 nm 基線(xiàn)噪音干擾并不明顯），峰面積見(jiàn)表7。

波長(zhǎng)選擇方面，比較了204、291、257 nm 三個(gè)波長(zhǎng)下落新婦苷和蘆丁的峰面積，考慮到兩種目標(biāo)產(chǎn)物的檢測(cè)，本方法最終選擇了波長(zhǎng)204 nm，光譜圖亦提示在這一波長(zhǎng)處兩種成分均有較大吸收，因此，檢測(cè)波長(zhǎng)由藥典上的雙波長(zhǎng)簡(jiǎn)化為單波長(zhǎng)。

圖5 75 μg／mL 落新婦苷150 μg／mL 蘆丁對(duì)照品溶液色譜圖（257 nm）Fig 5 Chromatogram of reference solution of 75 μg／mL astilbin and 150μg／mL rutin at 257 nm

圖6 75 μg／mL 落新婦苷150 μg／mL 蘆丁對(duì)照品溶液色譜圖（291 nm）Fig 6 Chromatogram of reference solution of 75 μg／mL astilbin and 150μg／mL rutin at 291 nm

圖7 腎復(fù)康合劑樣品色譜圖（出峰順序：蘆丁、落新婦苷）257 nmFig 7 Chromatogram of Shenfukang Mixture（peak sequence：rutin，astilbin） at 257 nm

圖8 腎復(fù)康合劑樣品色譜圖（出峰順序：蘆丁、落新婦苷）291 nmFig 8 Chromatogram of Shenfukang Mixture（peak sequence：rutin，astilbin） at 291 nm

圖9 75 μg／mL 落新婦苷150 μg／mL 蘆丁對(duì)照品溶液光譜圖Fig 9 Spectrogram of reference solution of 75μg／mL astilbin and 150μg／mL rutin

表7 與藥典規(guī)定波長(zhǎng)下比較相應(yīng)峰面積表Tab 7 comparison of peak response at the wavelength specified in Pharmacopoeia

3．2 流動(dòng)相的選擇 在色譜條件流動(dòng)相的選擇上，分別考察了有機(jī)相甲醇和乙腈及找到各自適合的比例，發(fā)現(xiàn)同一樣品采用乙腈洗脫相比甲醇，色譜圖中目標(biāo)峰響應(yīng)信號(hào)相對(duì)低一點(diǎn)，但根據(jù)兩種溶劑的截止波長(zhǎng)甲醇205 nm 和乙腈190 nm，因此，最終選擇了乙腈-0．1%甲酸系統(tǒng)。

本實(shí)驗(yàn)選擇了超高效液相色譜-紫外檢測(cè)法對(duì)腎復(fù)康合劑中落新婦苷和蘆丁進(jìn)行定性和定量測(cè)定。與普通高效液相色譜方法相比，鑒別增加了光譜法；二是定量的色譜圖出峰保留時(shí)間在5 min 左右，每針運(yùn)行時(shí)間10 min 足夠，流速0．35 mL／min；而普通液相每針運(yùn)行35 min，流速1．0 mL／min；超高效液相色譜方法比普通高效液相色譜方法運(yùn)行時(shí)間縮短25 min，每運(yùn)行一針流動(dòng)相節(jié)省31．5 mL。在廢液處理高成本的今天，超高效液相色譜方法更有優(yōu)勢(shì)，更經(jīng)濟(jì)和快捷。

綜上所述，使用超高效液相色譜法，對(duì)腎復(fù)康合劑中落新婦苷和蘆丁進(jìn)行定性和定量測(cè)定，方法快速，可以作為企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)方法，在產(chǎn)品工藝參數(shù)不斷調(diào)整優(yōu)化的過(guò)程中，具備精準(zhǔn)快捷、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的特點(diǎn)，可有效控制腎復(fù)康合劑的質(zhì)量。