微小RNA-155和CD4+調(diào)節(jié)性T細胞與冠狀動脈不穩(wěn)定斑塊的關(guān)系

賈敏 劉震 羅義 雷曉明 楊陽 陳平安

510095 廣州市胸科醫(yī)院綜合內(nèi)科(賈敏)；510180 廣州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科(劉震、羅義、雷曉明、楊陽、陳平安)

冠狀動脈內(nèi)不穩(wěn)定斑塊(unstable plague，UP)的形成、破裂及繼發(fā)血栓形成是導(dǎo)致急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)發(fā)生的最重要機制[1]。研究顯示，免疫炎癥在動脈粥樣硬化斑塊的形成和進展中起重要的促進作用。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)是體內(nèi)一群免疫抑制功能強大的T細胞亞群，在機體免疫穩(wěn)態(tài)維持中起重要作用[2]。微小RNA-155(microRNA-155，miR-155)是具有重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用的小分子RNA，與免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)相關(guān)[3]。本研究旨在探討循環(huán)miR-155和外周血CD4+Treg細胞與冠心病(coronary artery disease，CAD)患者UP的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 研究對象

本研究為回顧性研究。連續(xù)入選2016年1月至2018年1月在廣州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科住院并診斷為CAD的患者120例，男性68例，女性52例，年齡54～68歲，平均(61.8±6.9)歲。其中急性非ST段抬高型心肌梗死16例，不穩(wěn)定性心絞痛56例，穩(wěn)定性心絞痛48例。入選患者均接受冠狀動脈造影和血管內(nèi)超聲(intravascular ultrasound，IVUS)檢查。非ST段抬高型心肌梗死和不穩(wěn)定性心絞痛診斷符合《2011年美國不穩(wěn)定性心絞痛和非ST段抬高型心肌梗死治療指南》。排除標準：(1)需急診再灌注治療的急性ST段抬高型心肌梗死；(2)心源性休克；(3)嚴重肝腎功能不全、重癥感染、血液系統(tǒng)或自身免疫疾病、惡性腫瘤；(4)合并急性腦血管意外、消化道或泌尿系統(tǒng)等重要臟器活動性出血。

另外選取同期在體檢中心進行健康體檢的健康人群50名作為對照組，其中男性23名，女性27名，年齡48～71歲，平均(60.5±8.3)歲。本研究通過廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會審查，入選研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法與分組

1.2.1 血管內(nèi)超聲-虛擬組織學(xué)技術(shù)(intravascular ultrasound-virtual histology，IVUS-VH)[4]經(jīng)冠狀動脈造影后，對明確存在管腔直徑狹窄程度≥50%的冠狀動脈注入硝酸甘油200 U，之后使用iLab超聲診斷儀(Boston Scientific，美國)及Atlantis SR Pro冠狀動脈超聲成像導(dǎo)管(Boston Scientific，美國)，直徑3.6 F，頻率40 MHz，超聲探頭導(dǎo)管在X線透視下沿0.014英寸導(dǎo)引鋼絲進入冠狀動脈。到達狹窄病變處遠端后，自動回撤裝置將導(dǎo)管以0.50 mm/s的速度回撤，同時采集影像數(shù)據(jù)，錄盤分析。利用主機自帶iMap Basic Viewer軟件構(gòu)建組織圖像，測定病變血管外彈力膜橫截面積、管腔橫截面積、斑塊負荷及每種成分在斑塊中所占比例，以評價靶病變的斑塊性質(zhì)。IVUS-VH檢查血管內(nèi)橫截面積狹窄率超過40%、壞死組織超過10%、且靠近管腔的斑塊定義為UP[4]。據(jù)此，將入選的CAD患者分為穩(wěn)定斑塊(stable plaque，SP)組50例和UP組70例。

1.2.2 循環(huán)miR-155水平的檢測 所有研究對象均于清晨8時左右空腹狀態(tài)下留取靜脈血標本，置于乙二胺四乙酸(EDTA-K2)無菌抗凝試管中，2 h內(nèi)分離血漿，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)[5](Promega公司，美國)對血漿miR-155進行檢測，以人snRNA U6(Human snRNA U6)為內(nèi)參，定義ΔCt=目的基因(miR-155)Ct-內(nèi)參(U6)Ct；ΔΔCt=待測樣品中目的基因(miR-155)ΔCt-參照樣品中目的基因(miR-155)ΔCt，相對樣品模板量RQ=2-ΔΔCt(Ct值的含義：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))。以相對樣本模板量表示循環(huán)miR-155的相對表達量。

1.2.3 外周血CD4+Treg細胞水平的檢測 所有研究對象均于清晨8時左右空腹狀態(tài)下留取靜脈血標本2 ml，置于EDTA抗凝的真空采血管(去熱源與內(nèi)毒素)，輕輕混勻，標本于4 h內(nèi)測試完畢。采用直接免疫熒光法，用肝素鈉抗凝全血50 μl后加入10 μl FITC-CD4/APC-CD25二聯(lián)抗體，4℃下避光孵育30 min，用于標記CD4+CD25+Treg細胞，溶血洗滌后棄上清，洗滌后加入10 μl抗人Foxp3單克隆抗體于4℃下避光孵育30 min，再次洗滌后用500 μl染色緩沖液重懸，上流式細胞儀(Beckman，美國)分析，結(jié)果以CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占CD4+Treg細胞的比率表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基線資料

SP組、UP組和對照組的臨床基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)，見表1。

2.2 血漿miR-155和CD4+Treg水平

對照組、SP組和UP組患者的血漿miR-155和CD4+Treg水平比較，見表2。

2.3 UP組CAD患者血漿miR-155與CD4+Treg水平的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析顯示，UP組CAD患者的血漿miR-155相對表達量與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞水平呈正相關(guān)(r=0.476，P=0.013)。

2.4 血漿miR-155水平和外周血CD4+Treg水平與CAD患者冠狀動脈斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系

采用多因素logistic回歸方法分析包括年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、腎功能不全、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、高敏C反應(yīng)蛋白、同型半胱氨酸、N末端B型利鈉肽原、血漿miR-155相對表達量、外周血CD4+Treg水平等多個因變量與應(yīng)變量UP(有UP為1；無UP為0)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，血漿miR-155相對表達量、外周血CD4+Treg水平均是CAD患者冠狀動脈斑塊穩(wěn)定的獨立保護因子(OR=0.662，95%CI：0.472～0.819，P=0.011；OR=0.502，95%CI：0.376～0.765，P=0.019)，見表3。

3 討論

動脈粥樣硬化所致的心腦血管疾病是目前危害人類健康的首要疾病，而UP是導(dǎo)致心腦血管事件發(fā)生的關(guān)鍵。目前，CAD患者冠狀動脈內(nèi)是否存在UP主要通過侵入性檢查冠狀動脈造影或IVUS等手段來判斷[6]，缺乏對其早期預(yù)測和診斷的無創(chuàng)性檢查指標。動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿其起始、進展及至斑塊不穩(wěn)定的各個階段。CD4+Treg細胞是體內(nèi)一群免疫抑制功能強大的T細胞亞群，在機體全身及局部免疫穩(wěn)態(tài)維持中起重要作用，其特異性標志為細胞高表達CD25+和Foxp3+。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UP組患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占CD4+Treg細胞的比例明顯低于SP組和對照組，多因素回歸分析顯示，外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞水平是冠狀動脈內(nèi)斑塊穩(wěn)定的獨立保護因子。近期研究報道，小鼠動脈粥樣硬化模型外周血和斑塊中CD4+CD25+Foxp3+Treg數(shù)量減少、免疫抑制功能降低，而輸注CD4+CD25+Foxp3+Treg能使斑塊明顯變小[7]，提示動脈粥樣硬化形成涉及CD4+CD25+Foxp3+Treg的免疫調(diào)控機制，其變化是動脈粥樣硬化和ACS發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一。國內(nèi)胡英鋒等[8]發(fā)現(xiàn)，ACS患者外周血中Treg細胞表達百分比水平和功能顯著低于對照組，并且C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α等炎癥因子水平顯著升高，而炎癥抑制因子白細胞介素10、轉(zhuǎn)化生長因子β水平則明顯降低。本研究結(jié)果亦顯示，Treg細胞數(shù)量和功能活化是影響動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的重要因素。

表1 3組的臨床基線資料比較

注：B2/C型病變：符合美國心臟病學(xué)院基金會(ACCF)和美國心臟病協(xié)會(AHA)冠狀動脈病變分型標準B2型和C型

表2 3組血漿微小RNA-155和CD4+調(diào)節(jié)性T細胞水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與穩(wěn)定斑塊組比較，cP<0.01

近年研究顯示，循環(huán)miRs作為一類單鏈內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在患者生理或病理狀態(tài)下的變化早于其他生物標記物，并且具有良好的抗RNA酶降解能力和較高的穩(wěn)定性，有可能成為某些疾病的特異血清學(xué)生物標記物[9]。已有研究證實，miR-155可在T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核/巨噬細胞表達，并對炎癥免疫細胞的激活及免疫炎癥的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UP組CAD患者的血漿miR-155相對表達量明顯低于穩(wěn)定斑塊組，多因素logistic回歸分析顯示，血漿miR-155水平與CD4+Treg細胞表達水平均是冠狀動脈內(nèi)斑塊穩(wěn)定的保護因子，而UP組CAD患者的血漿miR-155與外周血CD4+Treg細胞水平呈正相關(guān)。Seddiki等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在胸腺細胞的分化過程中，miR-l55的表達升高可使CD4+Treg細胞Foxp3的表達上調(diào)，miR-l55的缺失會導(dǎo)致Treg細胞數(shù)量的減少。Yao等[11]通過轉(zhuǎn)染pre-miR-155和抗miR-155到純化的CD4+Treg細胞中，進行miR-155的過表達與抑制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pre-miR-155的CD4+Treg細胞中Treg細胞的數(shù)量比轉(zhuǎn)染抗miR-155的CD4+Treg細胞中的多，同時Treg細胞的特異性標志叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達也明顯上調(diào)，上述研究顯示miR-155具有調(diào)控Treg細胞上特異標記物的表達進而影響Treg細胞的功能及數(shù)量的效應(yīng)。從本研究結(jié)果來看，miR-155可能正性調(diào)節(jié)Treg細胞表達，進而通過Treg細胞的免疫抑制功能抑制冠狀動脈內(nèi)斑塊炎癥反應(yīng)，減緩斑塊進展至不穩(wěn)定狀態(tài)。

綜上所述，CAD患者血漿miR-155的水平可作為判斷和預(yù)測冠狀動脈內(nèi)斑塊穩(wěn)定性的一種重要血液學(xué)生物標記物。其通過正性調(diào)節(jié)外周血CD4+Treg細胞表達水平，抑制冠狀動脈內(nèi)及斑塊內(nèi)局部炎癥反應(yīng)，可能是維持冠狀動脈斑塊穩(wěn)定性的重要機制之一。但本研究仍存在樣本量偏小，研究的冠心病人群及觀察的炎癥指標較單一等缺陷，因此，本研究結(jié)果和結(jié)論有待將來大規(guī)模的臨床試驗進一步驗證。

表3 血漿微小RNA -155水平和外周血CD4+調(diào)節(jié)性T細胞水平與不穩(wěn)定斑塊的關(guān)系

利益沖突：無