血清卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性與冠心病的關(guān)系

王玉 于雪 張聞多 王欣越 楊睿悅 王思明 曾潔 唐月明 栗向輝 李紅霞 陳文祥 董軍 季福綏

100730 北京醫(yī)院生物化學(xué)與分子生物室，國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心(王玉、楊睿悅、王思明、唐月明、粟向輝、李紅霞、董軍)，心內(nèi)科(于雪、張聞多、王欣越、季福綏)；100730 北京，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心(曾潔、陳文祥)

研究發(fā)現(xiàn)，高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)降低是冠心病(coronary atherosclerosis heart disease，CAD)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[1]。然而，臨床研究中，具有升高HDL-C作用的膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(cholesterol ester transfer protein，CETP)抑制劑未取得預(yù)期效果[2-3]。卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(lecithin：cholesterol acyltransferase，LCAT，EC 2.3.1.43)是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的關(guān)鍵酶[4-5]，曾被認(rèn)為是HDL發(fā)揮CAD保護(hù)作用的重要因素。但由于缺乏簡(jiǎn)便、可靠的LCAT活性測(cè)定方法，LCAT活性與冠心病的關(guān)系仍無(wú)定論。我們建立高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定LCAT活性的方法，與傳統(tǒng)的同位素示蹤法相比，安全、簡(jiǎn)便、精密，可準(zhǔn)確評(píng)估人群中LCAT的活性。本研究采用HPLC法測(cè)定行冠狀動(dòng)脈造影患者血清的LCAT活性，分析LCAT活性與CAD及其危險(xiǎn)因素的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為病例對(duì)照研究。納入2014年11月至2015年8月在北京醫(yī)院行冠狀動(dòng)脈造影的425例患者，年齡17～91歲，男性291例(58.2%)，女性209例(41.8%)。根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果分為CAD組(341例)和非CAD組(84例)。CAD定義為冠狀動(dòng)脈造影顯示左前降支、左回旋支、右冠狀動(dòng)脈及其主要分支中至少有一支血管管腔狹窄程度≥50%[6]；非CAD患者定義為上述血管管腔狹窄程度<50%。收集患者的既往史、個(gè)人史、家族史、血壓、血脂和血糖等臨床資料。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求，已通過(guò)北京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

采集血液樣本后，1 h內(nèi)分離血清后分裝，-80℃冰凍保存待測(cè)。測(cè)定時(shí)將血清樣本融化并使之恢復(fù)到室溫，搖勻，采用HPLC測(cè)定血清LCAT活性。每次重復(fù)測(cè)定25～30個(gè)樣本、2個(gè)質(zhì)控血清，共進(jìn)行18次，完成全部樣本的測(cè)定。將-80℃凍存的脂質(zhì)體、血清和質(zhì)控血清取出，平衡至室溫。用加樣器吸取500 μl的脂質(zhì)體至冰水浴中的預(yù)冷的試管中，再用加樣器精密吸取10 μl血清或質(zhì)控樣本于脂質(zhì)體中，37℃溫育1 h； 溫育結(jié)束后將試管置于冰水浴中并加入500 μl乙醇終止反應(yīng)，加入正己烷1 ml，渦旋震蕩20 min抽提脂質(zhì)；轉(zhuǎn)移正己烷層500 μl至HPLC樣瓶，減壓干燥，用200 μl的流動(dòng)相重組，混勻后進(jìn)行HPLC分析。本研究使用的儀器包括Agilent 1200高效液相色譜儀(Agilent公司，美國(guó))；Nova-Pak C18色譜柱(5 μm，3.9 mm×150 mm，Waters公司，美國(guó))；有機(jī)溶劑乙腈、異丙醇、正己烷、無(wú)水乙醇等為HPLC級(jí)(Fisher Scientific公司，美國(guó))，以及其他試劑，如甲醇、氯仿、磷酸鹽(北京化學(xué)試劑公司)。

血清樣本的常規(guī)生化指標(biāo)，如血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、隨機(jī)血糖(glucose，GLU)等采用酶法測(cè)定；HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)采用勻相法測(cè)定；ApoAI、ApoB采用免疫比濁法。所有試劑均為Roche公司產(chǎn)品(瑞士)，按試劑盒說(shuō)明書于自動(dòng)生化分析儀(日立7180，日本)測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組的一般資料比較

CAD組中LCAT活性顯著高于非CAD組，而男性為(37.3±8.4)nKat/L，女性(36.0±6.8)nKat/L，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，兩組的HDL-C、ApoAI和隨機(jī)血糖等均有顯著差異(均為P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 血清LCAT與CAD危險(xiǎn)因素的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，LCAT活性與BMI(r=0.09)、TG(r=0.30)、ApoB(r=0.22)和隨機(jī)血糖(r=0.09)呈正相關(guān)；與HDL-C (r=-0.26)呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)表2。

2.3 單因素和多因素logistic回歸分析

單因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，LCAT活性升高是CAD危險(xiǎn)因素(OR=3.11，95%CI：1.40～6.91，P=0.005)，在校正年齡、性別、HDL-C、ApoAI、隨機(jī)血糖等危險(xiǎn)因素后，多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)LCAT的活性升高仍是CAD危險(xiǎn)因素(OR=3.28，95%CI：1.27～8.50，P=0.014)。

3 討論

早期研究認(rèn)為，LCAT活性升高是CAD的保護(hù)因素。Sethi等[7]采用外源底物法測(cè)定缺血性心臟病和正常對(duì)照組人群血清的LCAT活性，去除年齡和性別因素后發(fā)現(xiàn)，CAD患者的LCAT活性明顯降低，LCAT活性是CAD的保護(hù)性因素。然而，既往研究先后采用內(nèi)/外源底物法，測(cè)定樣本血清LCAT活性[6，8-9]，發(fā)現(xiàn)LCAT活性與TC、TG、ApoB等CAD危險(xiǎn)因素正相關(guān)，且CAD組的LCAT活性較對(duì)照組高(P=0.027)，故LCAT活性可作為AS亞臨床診斷和預(yù)測(cè)的標(biāo)志物。但是，既往研究中LCAT活性測(cè)定方法復(fù)雜多樣。其中，內(nèi)源底物法受血清脂質(zhì)組成的影響，不能反映血清LCAT的真實(shí)活性[10-11]；外源底物法設(shè)計(jì)各異[12-14]，去除底物和內(nèi)源脂質(zhì)影響的程度不同，且脂質(zhì)體制備復(fù)雜，不同方法測(cè)定的LCAT活性可能具有不同的生物學(xué)意義，導(dǎo)致結(jié)果缺乏可比性。針對(duì)以上各種問(wèn)題，我們建立了一種簡(jiǎn)便、精密、可靠的HPLC測(cè)定人血清LCAT活性的方法[15]，且基本不受內(nèi)/外源底物和物質(zhì)的影響，適用于高通量臨床應(yīng)用。

表1 兩組的LCAT活性與其他參數(shù)的差異

表2 LCAT活性與CAD危險(xiǎn)因素的相關(guān)性分析

LCAT活性與CAD的關(guān)系仍有爭(zhēng)議。近期研究發(fā)現(xiàn)，LCAT與多種CAD危險(xiǎn)因素相關(guān)，LCAT可能促進(jìn)CAD的發(fā)生，是CAD的危險(xiǎn)因素。但是，多數(shù)研究?jī)H評(píng)估LCAT活性與CAD危險(xiǎn)因素或頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度的關(guān)系，較少有大規(guī)模研究評(píng)估LCAT活性與CAD的關(guān)系。與既往研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)，CAD患者的LCAT活性顯著增高，且LCAT活性與BMI(r=0.09)、TG(r=0.30)、ApoB(r=0.22)和隨機(jī)血糖(r=0.09)正相關(guān)；與HDL-C(r=-0.26)負(fù)相關(guān)。校正年齡、性別、HDL-C、ApoAI和血糖等因素后，多因素logistic回歸分析提示LCAT活性升高仍是CAD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。然而，部分研究發(fā)現(xiàn)，LCAT活性與HDL-C正相關(guān)。但既往研究樣本量較小，LCAT與CAD的關(guān)系仍需更多研究證實(shí)。

本研究有一些局限性，包括對(duì)照組為冠脈狹窄<50%的患者而非冠狀動(dòng)脈正常人群，而此類患者可能存在動(dòng)脈粥樣硬化或?yàn)楣谛牟〉母呶Ｈ巳?，因此?huì)低估病例/對(duì)照組間的差異，對(duì)結(jié)果造成一定的偏倚。此外，樣本量較小，難以進(jìn)一步探討LCAT活性與冠心病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

綜上所述，本研究揭示了LCAT活性升高與多種CAD危險(xiǎn)因素相關(guān)，是CAD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但仍需更多研究證實(shí)。

利益沖突：無(wú)