萋-尼抗酸染色冷染法與熱染法結果比較分析

胡昌弟　余旭良

[摘要] 目的 比較萋-尼抗酸染色（簡稱Z-N染色）冷染法與熱染法查找抗酸桿菌的差異，探討萋-尼抗酸染色冷染法的應用價值。 方法 選取2017年1～12月衢州市人民醫(yī)院確診為肺結核患者的痰標本355份，每份痰標本涂6張涂片。室溫下干燥后于5 s內穿過酒精燈火焰上方4次固定。其中冷染法3張涂片滴加含有1% Triton X-100石碳酸復紅染液，置室溫5 min、15 min、30 min后分別用流水緩慢沖去染色液;再滴加5%鹽酸酒精脫色1～3 min，用水緩慢沖洗;最后用堿性美蘭復染1 min，用水緩慢沖洗;干燥后，用油鏡觀察。熱染法3張涂片滴加不含1% Triton X-100石碳酸復紅染液，然后加熱到微微冒熱氣，分別放置5 min、15 min、30 min后用流水緩慢沖去染色液;其余步驟操作同冷染法。比較兩種方法抗酸桿菌的陽性檢出率、褪色速度等方面的差異。 結果 355份痰標本冷染法5 min、15 min、30 min陽性率分別為29.57%、32.68%、32.68%，平均陽性率為31.64%;355份痰標本熱染法5 min、15 min、30 min陽性率分別為32.96%、32.68%和32.96%，平均陽性率為32.87%;經(jīng)統(tǒng)計，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。兩種方法的陽性片褪色速度結果比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 結論 在萋-尼抗酸染色初染液石碳酸復紅中加入表面活性劑Triton X-100，能改變分枝桿菌細胞壁的通透性，促進染料進入分枝桿菌的菌體?？顾釛U菌陽性檢出率和陽性片的褪色速度與傳統(tǒng)的熱染法比較，差異均無統(tǒng)計學意義。與傳統(tǒng)熱染法比較，操作簡單并避免了有害氣體污染環(huán)境，是一種值得推廣的方法。

[關鍵詞] 萋-尼抗酸染色;抗酸桿菌;冷染法;熱染法

[中圖分類號] R446? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）15-0110-04

Comparative analysis of the results of cold staining and heat staining of Ziehl-Neelsen acid-fast staining

HU Changdi? ?YU Xuliang

Department of Clinical Laboratory， Quzhou People's Hospital in Zhejiang Province， Quzhou? ?324000， China

[Abstract] Objective To compare the difference between Ziehl-Neelsen acid-fast staining cold staining and heat staining in finding acid-fast bacilli， and to explore the application value of cold staining method and heat staining method of Ziehl-Neelsen acid-fast staining. Methods A total of 355 specimens of sputum in diagnosed tuberculosis patients from January to December 2017 in Quzhou People's Hospital were selected. Six smears were applied to each sputum specimen. After drying at room temperature， it was fixed 4 times over the flame of the alcohol lamp within 5 s. Among them， 3 smears of cold staining method were added with 1% Triton X-100 stone carbonate red dyeing solution， and left at room temperature for 5 min， 15 min and 30 min， then slowly washed away the staining solution with running water. And then the smears were added with 5% hydrochloric acid alcohol to decolorize for 1-3 min and rinsed slowly with water. Finally the smears were counterstained with alkaline melanin for 1 min， and rinsed slowly with water. After drying， they were observed with oil mirror. The three smears of the heat-dyeing method were added with 1% Triton X-100 stone carbonate red dyeing solution， and then heated to slightly hot air， and the dyeing liquid was slowly washed away with running water for 5 min， 15 min and 30 min respectively. The remaining step operation was the same as the cold dyeing method. The difference in the positive detection rate and the fading speed of the acid-fast bacilli was compared between the two methods. Results The positive rates of 355 sputum samples of cold staining for 5 min， 15 min and 30 min were 29.57%， 32.68% and 32.68%， respectively. The average positive rate was 31.64%. The positive rates of 355 sputum specimens of thermal dyeing method for 5 min， 15 min and 30 min were 32.96%， 32.68%， and 32.96%， respectively， and the average positive rate was 32.87%. There was no statistically significant difference （P>0.05）. There was no significant difference in the fading speed of the positive films between the two methods（P>0.05）. Conclusion The addition of the surfactant Triton X-100 to the stone carbonate red initial dyeing solution of Ziehl-Neelsen stain can change the permeability of the mycobacterial cell wall and promote the entry of the dye into the mycobacteria. The positive detection rate of acid-fast bacilli and the fading rate of positive tablets are not significantly different from those of traditional heat-staining methods. And the method is simple to operate and avoids harmful gas pollution to the environment compared with the traditional thermal dyeing method. It is a method worth promoting.

[Key words] Ziehl-Neelsen acid-fast staining; Acid-fast bacilli; Cold staining method; Thermal dyeing method

目前，全球有大約1/3的人口感染結核分枝桿菌，有2000萬活動性結核病患者，每年新發(fā)病例900萬人，每年約有300萬人死于結核病。中國是全球22個結核病高負擔國家之一，我國結核病年發(fā)病人數(shù)約為 130萬，占全球發(fā)病人數(shù)的14%，位居全球第2位[1]。一種好的檢測、診斷方法對結核病的防控起到至關重要的作用。隨著實驗室診斷技術的發(fā)展，很多先進的技術被應用，Xpert MTB/RIF檢測具有準確、快速、安全性高等優(yōu)點[2-4]，但費用昂貴，患者較難承受。結核分枝桿菌液體培養(yǎng)雖然敏感度高，而且能進行菌種鑒定和藥敏試驗，但是操作相對比較繁瑣，培養(yǎng)周期較長，平均報告陽性的時間需13 d[5]，陰性更是需42 d。因此痰涂片抗酸染色目前仍是各實驗室重要檢測結核分枝桿菌的方法。相對于其他檢測方法，高質量的痰涂片鏡檢有自身特有的優(yōu)勢：（1）作為診斷手段，對傳染性肺結核的診斷比X線的準確性高。（2）作為實驗方法，技術相對簡單，容易標準化和完成操作。（3）設備投入少，檢查成本低。（4）從收到標本到報告結果的時間短，能夠滿足臨床診斷的需要。（5）對涂陽患者的治療效果，能夠做出及時和準確的評價[6]。Z-N染色作為經(jīng)典的涂片抗酸染色方法，目前仍被各個醫(yī)院廣泛使用。但是傳統(tǒng)的熱染法，在滴加石碳酸復紅后需要加熱，操作較為繁瑣，而且石碳酸復紅染液在加熱時會產(chǎn)生揮發(fā)性苯酚氣體，這種氣體會污染環(huán)境，影響實驗室工作人員的身體健康[7]。本文通過比較分析冷染法與熱染法結果的差異，探討萋-尼抗酸染色冷染法的應用價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集衢州市人民醫(yī)院2017年1～12月確診為結核患者痰標本355份，所有標本為患者漱口后咳出的深部痰液，放置于無菌痰盒內。

1.2 染液配置

1.2.1 石碳酸復紅染液? 稱取堿性復紅1 g 溶于10 mL 95% 乙醇中，然后加入5%石碳酸水溶液，直至100 mL。此染液用于熱染法初染。

1.2.2 1%Triton X-100石碳酸復紅染液? 取1.2.1項石碳酸復紅染液100 mL，加入Triton X-100 至終濃度為1%，此染液用于冷染法初染。

1.2.3 5%鹽酸乙醇脫色液? 取濃鹽酸5 mL，緩慢加入95 mL 95%乙醇中。用于冷染法和熱染法的脫色。

1.2.4 堿性美藍復染液? 取美藍0.3 g，溶于50 mL 95% 乙醇中，加蒸餾水至 100 mL。使用時用蒸餾水進行5倍稀釋。用于冷染法和熱染法的復染。

1.3 主要材料

奧林巴斯 CX211顯微鏡、青島海爾 HR40-ⅡB2 生物安全柜，帆船牌清潔﹑無油脂一端磨砂面的新玻片。

1.4 染色方法

1.4.1 涂片制備? 取脫脂干燥的新玻片，用2B鉛筆在磨砂一端寫上患者姓名和編號，用折斷的竹簽茬端，挑取痰標本中呈膿樣﹑干酪樣可疑部分均勻涂抹成約10 mm×20 mm的卵圓形痰膜，每份痰標本涂片6張，盡量使每張?zhí)灯娜√挡课哗p痰膜厚度﹑痰膜大小基本一致;將涂好的痰涂片室溫下干燥后于5 s內穿過酒精燈火焰上方4次將其固定。

1.4.2 染色方法? Z-N染色按《中國結核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》規(guī)定方法進行初染﹑脫色﹑復染[6]。其中熱染法3張涂片滴1.2.1項石碳酸復紅染液，染液要覆蓋痰膜，然后加熱到微微冒熱氣分別放置5 min、15 min、30 min后，用流水緩緩沖掉染液;再滴加5%鹽酸酒精脫色1～3 min，用水緩慢沖洗;最后用堿性美蘭復染1 min，用水緩慢沖洗;干燥后，用油鏡觀察。冷染法3張涂片滴加1.2.2項石碳酸復紅染液后，染液要覆蓋痰膜，放室溫不加熱，分別在5 min、15 min、30 min后，用流水緩緩沖掉染液;再滴加5%鹽酸酒精脫色1～3 min，用水緩慢沖洗;最后用堿性美蘭復染1 min，用水緩慢沖洗;干燥后，用油鏡觀察。

1.5 結果判斷

顯微鏡鏡檢及結果判斷嚴格按《中國結核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[6]?？顾釛U菌陰性：連續(xù)觀察300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌;報告抗酸桿菌數(shù)：1～8條/300個視野;抗酸桿菌（+）為3～9條/100個視野，連續(xù)觀察300個視野;抗酸桿菌（++）為1～9條/10個視野，連續(xù)觀察100個視野;抗酸桿菌（+++）為1～9條/每個視野，連續(xù)觀察50個視野?？顾釛U菌（++++）為≥10條/每個視野，連續(xù)觀察50個視野。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 冷染法與熱染法檢測結果比較

冷染法5 min、15 min、30 min陽性率分別為29.57%、32.68%、32.68%;平均陽性率為31.64%;熱染法5 min、15 min、30 min陽性率分別為32.96%、32.68%和32.96%，平均陽性率為32.87%。其中冷染法5 min的陽性率略低于同組別15 min和30 min的陽性率。冷染法5 min、15 min 和30 min比較，各陽性等級差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。熱染法5 min、15 min、30 min的結果比較，各組各陽性等級差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。熱染法與冷染法比較，各組之間均無明顯差異（P>0.05）（表1）。

2.2 冷染法與熱染法褪色速度比較

收集染色15 min所有陽性片（冷染法116張，熱染法116張）進行褪色速度試驗，每周重復閱讀這些陽性片，當陽性變?yōu)殛幮曰虺霈F(xiàn)量化誤差即為褪色，統(tǒng)計結果表明冷染法與熱染法陽性涂片褪色速度結果比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表2）。

3 討論

隨著實驗室診斷技術的發(fā)展，更多地檢測技術被運用到痰標本檢測中。Xpert MTB/RIF作為近年來發(fā)展起來的一種新的實時定量PCR檢測技術，具有準確、快速、安全性高等優(yōu)點，可同時對結核分枝桿菌以及利福平耐藥進行快速檢測，對于早期診斷發(fā)現(xiàn)傳染源，控制結核病流行傳播具有重要意義。但由于目前該檢測項目尚未納入醫(yī)保，昂貴的檢測費用以及檢測需要相關的儀器，從而限制了其在基層醫(yī)院的使用[8-9]。結核分枝桿菌液體培養(yǎng)是在培養(yǎng)管底部包埋熒光物質，可隨著管內氧含量的變化而發(fā)生反應，若管中有分枝桿菌生長，則管內氧氣被消耗，管底熒光物質被激活，在特定光源的激發(fā)下釋放熒光，系統(tǒng)每小時監(jiān)測培養(yǎng)管內的熒光強度1次，從而判斷管內分枝桿菌生長情況[10-11]。當痰中細菌達到100個/mL即能檢出，但培養(yǎng)周期較長，平均報告陽性的時間需要13 d，陰性更是需42 d。因此，痰涂片鏡檢目前仍是各實驗室重要檢測結核分枝桿菌的方法。萋-尼氏抗酸染色鏡檢是目前國內主要的痰涂片鏡檢方式[12]。但是傳統(tǒng)的熱染法，在滴加石碳酸復紅后需要加熱，操作較為繁瑣，且石碳酸復紅染液在加熱時會產(chǎn)生揮發(fā)性苯酚氣體，這種氣體會污染環(huán)境，影響實驗室工作人員的身體健康。

結核分枝桿菌細胞壁中含有大量脂質而不易著色，由于結核桿菌細胞結構和細胞成分的這一特殊性，具有經(jīng)堿性染料染色后能耐受酸性介質脫色的特性。萋尼染色的基本原理即根據(jù)結核桿菌這一特性先用石碳酸復紅加溫使抗酸桿菌著色，加溫著色后的抗酸桿菌能夠耐受酸性酒精脫色，顯微鏡觀察時保持紅色，而其他脫落細胞以及標本中的非抗酸菌被酸性酒精脫色后可被復染液美藍染為藍色[13]。

Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）是一種非離子型表面活性劑，能改變分枝桿菌細胞壁的通透性，促進染料進入分枝桿菌的菌體，在初染液中加入Triton X-100起到助染的作用，無需加熱即能使抗酸桿菌著色[14]。著色后的抗酸桿菌同樣能夠耐受酸性酒精脫色，抗酸桿菌保持紅色，而其他脫落細胞以及標本中的雜菌被酸性酒精脫色后可被復染液美藍染為藍色。此外Triton X-100還是一種很好的分散劑，能分散標本中成堆出現(xiàn)的分枝桿菌，更利于找到抗酸桿菌。

本研究表1顯示，冷染法5 min、15 min、30 min陽性率分別為29.57%、32.68%、32.68%，平均陽性率為31.64%;結果與相關報道一致[15-17]。熱染法5 min、15 min、30 min陽性率分別為32.96%、32.68%和32.96%，平均陽性率為32.87%，結果與相關報道一致[18-20]。冷染法5 min、15 min和30 min比較，各組各陽性等級差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。熱染法與冷染法比較，各組之間均無明顯差異（P>0.05）。

通過觀察，熱染法組隨著染色的時間的延長陽性率未有明顯的差異，顯微鏡下看到的抗酸桿菌紅色明顯，表明只要按照《中國結核病防治規(guī)劃﹑痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》規(guī)定加熱5 min即能滿足要求。冷染組初染時間5 min的陽性率略低于其他組別，這可能由于少部分細菌細胞壁較厚，染料進入菌體較慢，但隨著初染時間增加到15min，其染色的結果與所有的熱染法比較，陽性率無明顯差異，表明少部分未染上色的抗酸桿菌，通過延長染色時間還是能著色的。因此，我們建議用冷染法時，第一步初染的時間不能低于15 min。

本研究結果顯示，冷染法與熱染法陽性涂片褪色速度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），兩者的分枝桿菌形態(tài)也無差異。因此，冷染法與熱染法對陽性片的保存、實驗人員的鏡檢以及盲法復檢可完全等同操作。

目前實驗室檢測結核桿菌的方法很多，但傳統(tǒng)的Z-N染色，仍然以其價廉、簡單、快速以及能對患者的療效評價等優(yōu)點，為廣大醫(yī)院所使用。但是傳統(tǒng)的熱染法，在滴加石碳酸復紅后需要加熱，操作較為繁瑣，而且石碳酸復紅染液在加熱時會產(chǎn)生揮發(fā)性苯酚氣體，這種氣體會污染環(huán)境，影響實驗室工作人員的身體健康。冷染法是傳統(tǒng)法的初染液石碳酸復紅中加入表面活性劑Triton X-100，能改變分枝桿菌細胞壁的通透性，促進染料進入分枝桿菌的菌體，只要把第一步初染的時間延長到15 min，即能得到可靠的結果。

綜上所述，冷染法對比傳統(tǒng)的熱染法，減少了加熱等繁瑣的步驟，減少了苯酚等有害氣體對實驗室環(huán)境以及人員的影響，是一種值得推廣的方法。

[參考文獻]

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