反相高效液相色譜法同時(shí)測定茶堿和3種抗癲癇藥血藥濃度

謝軍平，馮玲玲，楊瑞玲

(1.河南省開封市第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，河南 開封 475000; 2.河南大學(xué)附屬東京醫(yī)院藥劑科，河南 開封 475000)

反相高效液相色譜法同時(shí)測定茶堿和3種抗癲癇藥血藥濃度

謝軍平1，馮玲玲1，楊瑞玲2

(1.河南省開封市第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，河南 開封 475000; 2.河南大學(xué)附屬東京醫(yī)院藥劑科，河南 開封 475000)

目的建立可同時(shí)測定茶堿和苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平血藥濃度的反相高效液相色譜法。方法色譜柱為Promosil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇－水(60∶40)，檢測波長205 nm，流速0.7 mL/min，柱溫25℃。結(jié)果該色譜條件下，茶堿、苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平分離良好，血藥濃度線性范圍茶堿為 0.30 ～ 180.00 μg/mL(r=0.999 7)，苯巴比妥為 0.42 ～169.60 μg/mL(r=0.999 9)，苯妥英鈉為 0.40 ～ 170.00 μg/mL(r=0.999 2)，卡馬西平為 0.20 ～140.00 μg/mL(r=0999 8)，平均回收率分別是 97.3% ，98.0% ，103.1%，99.3%，日內(nèi)及日間精密度RSD均小于6%。結(jié)論該方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確，4種藥物互不干擾，可用于臨床血藥濃度監(jiān)測。

反相高效液相色譜法;茶堿;抗癲癇藥;血藥濃度

茶堿臨床上主要用于治療哮喘和哮喘型慢性支氣管炎，但其治療窗窄(10～20 μg/mL)，易引起頭暈、心悸、心律失常、血壓劇降、驚厥等茶堿中毒癥狀?？拱d癇藥苯巴比妥對肝藥酶有誘導(dǎo)作用，會(huì)影響其他藥物的正常代謝;苯妥英鈉個(gè)體差異大，是典型非線性動(dòng)力學(xué)代謝的藥物;卡馬西平由于自身誘導(dǎo)代謝，會(huì)使血藥濃度發(fā)生較大的變化。臨床上治療癲癇時(shí)多主張單一用藥，但對于難治性癲癇多采用多藥聯(lián)用的治療方案，不可避免地會(huì)導(dǎo)致抗癲癇藥之間的相互作用，且大多數(shù)抗癲癇藥的治療窗窄、個(gè)體間及個(gè)體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征差異顯著[1]，使得血藥濃度變化較大。為最大限度地提高藥物療效，降低藥品不良反應(yīng)，以達(dá)到合理的個(gè)體化用藥，監(jiān)測血藥濃度顯得尤為重要。筆者建立了可同時(shí)測定茶堿和3種抗癲癇藥血液濃度的反相高效液相色譜法，樣品處理過程簡單，測定快速、準(zhǔn)確、專屬性好，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC－20AT型高效液相色譜儀，包括二元梯度泵、SPD－20A型紫外檢測器、LC solution工作站(日本島津);高速冷凍離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司);WXH微型旋渦混合器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。茶堿、苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平對照品(中國藥品生物制品檢定所);甲醇為色譜純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Promosil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 －水(60 ∶40);流速:0.7 mL/min;柱溫:25 ℃;檢測波長:205 nm;進(jìn)樣量:10 μL。在此條件下，空白血清及空白血清加對照品的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的茶堿、苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平對照品，置25 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，得茶堿標(biāo)準(zhǔn)貯備液(150 μg/mL)、苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)貯備液(212 μg/mL)、苯妥英鈉標(biāo)準(zhǔn)貯備液(200 μg/mL)、卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)貯備液(100 μg/mL)，于4℃冰箱貯存。

2.3 血清樣品處理

精密量取血清0.2 mL，置1.5 mL尖底塑料離心管中，加入甲醇0.5 mL，渦旋3 min，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液，經(jīng) 0.45 μm 過濾器過濾，取 10 μL 進(jìn)樣。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

因測定的范圍較廣，故精密吸取各藥物的標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL，置50 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度定容，制成稀釋混合工作液，精密吸取上述稀釋混合工作液20，50，100 μL;分別精密吸取茶堿、苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，加入空白血清，使成不同質(zhì)量濃度梯度(茶堿為 0.30，0.75，1.50，7.50，22.50，75.00，135.00，180.00 μg/mL; 苯 巴 比 妥 為 0.42，1.05，2.10，5.30，21.20，84.80，127.20，169.60 μg/mL;苯 妥英 鈉 為 0.40，1.00，2.00，5.00，20.00，80.00，120.00，170.00 μg/mL;卡馬 西平為0.20，0.50，1.00，5.00，25.00，60.00，100.00，140.00 μg/mL)的血清樣品，按2.3項(xiàng)下血清樣品處理方法處理。用外標(biāo)法峰面積定量，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果茶堿、苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平的出峰時(shí)間分別為2.8，4.5，6.7，7.5 min?；貧w方程、線性范圍及檢測限見表 1。

2.5 回收率及試驗(yàn)

將每種藥物均配制成低、中、高3種質(zhì)量濃度的含藥血清各5份，按2.3項(xiàng)下血清樣品處理方法處理后進(jìn)樣分析，將測得的峰面積代入回歸方程計(jì)算測得量，測得量與加入量之比即為相對回收率;另用水準(zhǔn)確配制高、中、低3種質(zhì)量濃度的含藥血清樣品各5份，同法處理，以血清峰面積與未經(jīng)提取的相同量標(biāo)準(zhǔn)品峰面積之比，計(jì)算其絕對回收率。結(jié)果見表2。

表1 茶堿、苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 精密度試驗(yàn)

分別在同日內(nèi)測定5次和連續(xù)5 d每天測定1次血藥濃度，計(jì)算日內(nèi)精密度、日間精密度。結(jié)果見表2。

表2 茶堿、苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平的回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.7 干擾試驗(yàn)

從臨床合并用藥情況看，地西泮、硝西泮、撲米酮、丙戊酸等多種藥物均不干擾茶堿、苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平的測定。

3 討論

本方法中采用的柱溫、流速均較文獻(xiàn)[2－4]報(bào)道的低，相對可延長色譜柱的使用壽命。參考相關(guān)文獻(xiàn)，分別選擇不同的檢測波長(205，210，220，230，240，254，280 nm)及不同比例的甲醇 － 水流動(dòng)相(50 ∶50，55 ∶45，60 ∶40)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果選擇檢測波長為 205 nm、流動(dòng)相為甲醇－水(60∶40)。在此色譜條件下，茶堿、苯巴比妥、苯妥英鈉的檢測色譜信號響應(yīng)大大提高，卡馬西平的檢測色譜信號響應(yīng)比210 nm波長處稍低但比其他波長處均高，無需在流動(dòng)相中加入改性劑如正丁胺、乙二胺或冰醋酸等，4種藥物分離良好。本方法避免了文獻(xiàn)中樣品預(yù)處理時(shí)使用乙醚或改變酸堿度、試劑貴、揮發(fā)性大、易燃、不太穩(wěn)定、放置后易產(chǎn)生過氧化物、用前需作煩瑣的預(yù)處理、操作費(fèi)時(shí)的缺陷。所用的流動(dòng)相為甲醇－水，呈中性，對色譜柱及儀器的損害小，沉淀劑為甲醇一次沉淀，高速(12 000 r/min)離心后直接進(jìn)樣，減少了提取液吹干、流動(dòng)相復(fù)溶的步驟，避免了分離體積不易控制、操作時(shí)間長的缺點(diǎn)。筆者建立的反相高效液相色譜法具有靈敏度高、專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，其測定的線性范圍較文獻(xiàn)報(bào)道的廣，且茶堿測定的線性范圍尚未見報(bào)道。此方法樣品預(yù)處理簡單，只需甲醇一次沉淀蛋白即可，約8 min可測定1個(gè)樣品，精密度好，回收率高，不需要改變實(shí)驗(yàn)方法和色譜條件即可同時(shí)測定4種藥物，提高了工作效率，擴(kuò)展了適應(yīng)性，適用于臨床治療藥物血藥濃度的監(jiān)測。

[1]焦 正，鐘康明，施孝金，等.抗癲癇藥物監(jiān)測[J].中國臨床藥學(xué)雜志，2004，13(6):386 －389.

[2]陳 玲，羅文鴻，李 慧，等.高效液相色譜法同時(shí)測定血清中苯妥英、卡馬西平的濃度[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2000，20(11):645－647.

[3]李碧峰，馮惠平，賈晉蓉，等.RP－HPLC法測定人血漿中苯巴比妥的濃度[J].中國藥房，2008，19(26):2 024 －2 026.

[4]蔡 洪.HPLC法同時(shí)測定三種抗癲癇藥物的血清濃度[J].湖南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2000，2(4):32－34.

Simultaneous Determination of Serum Concentrations of Theophylline and Three Antiepileptic Drugs by RP－HPLC

Xie Junping1，F(xiàn)eng Lingling1，Yang Ruiling2
(1.Department of Clinical Pharmacy，Kaifeng First People's Hospital，Kaifeng，Henan，China475000;
2.Department of Pharmacy，Affiliated Dongjing Hospital，Henan University，Kaifeng，Henan，China475000)

ObjectiveTo establish a method for determining the serum concentrations of theophylline， Phenobarbital， phenytoin sodium and carbamazepine by RP － HPLC.Methods The analytical column was Promasil C18column(150 mm × 4.6 mm，5 μm).The mobile phase consisted of methanol－ water(60 ∶40)at the flow rate of 0.7 mL/min.The detection wavelength was set at 205 nm and the column temperature was set at 25 ℃.Results Theophylline，phenobarbital，phenytoin sodium and carbamazepine were separated well under the chromatographic condition.The linear ranges were 0.30 － 180.00 μg/mL(r=0.999 7)for theophylline，0.42 － 169.60 μg/mL(r=0.999 9)for phenobarbital，0.40 － 170.00 μg/mL(r=0.999 2)for phenytoin sodium and 0.20 － 140.00 μg/mL(r=0.999 8)for carbamazepine respectively.The mean relative recovery rates of theophylline，Phenobarbital，phenytoin sodium and carbamazapine were 97.3% ，98.0% ，103.1% and 99.3% respectively.The intra － day and the inter－ dayRSDall was less than 6%.Conclusion This method is simple，rapid，accurate without interfering with each other，which is suitable for the blood concentration monitoring of therapeutic drugs.

RP－HPLC;theophylline;antiepileptic drug;serum drug concentration

R969.1;R927.2

A

1006－4931(2011)02－0022－03

謝軍平，女，本科，副主任藥師，(電話)0378－5672547(電子信箱)xjp630@163.com。

2010－01－04;

2010－04－28)