膝三臟湯不同工藝提取物對KOA模型大鼠血清炎癥因子及軟骨端粒酶活性的影響

邢振龍， 戚子榮， 丘青中

（廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東廣州 528200）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是以膝關(guān)節(jié)軟骨及周圍肌肉、滑膜、韌帶或其他結(jié)構(gòu)慢性無菌性炎癥為主要表現(xiàn)，伴隨關(guān)節(jié)間隙變窄、關(guān)節(jié)邊緣及脛骨髁間隆突骨贅形成的病癥[1]。其中醫(yī)病機(jī)以肝腎虧虛為主，筋骨肌肉失養(yǎng)所致。膝乃筋骨肉之大會，由肝、腎、脾三經(jīng)所系，肝藏血、主筋，腎藏精、主骨生髓，脾主運化、合肉，故治療當(dāng)從“肝—脾—腎”三臟一體整體觀念出發(fā)，以三臟同治、先后天同治為法，從而達(dá)到滋補肝腎、強筋壯骨、益氣健脾、通絡(luò)止痛之效。膝三臟湯是嶺南名醫(yī)丘青中教授30多年臨床經(jīng)驗的結(jié)晶，為經(jīng)驗方，療效好[2-4]。本課題組前期研究表明，膝三臟湯復(fù)方粗液可抑制大鼠KOA模型的炎癥因子釋放[5]，但粗液成分復(fù)雜，難以進(jìn)一步深入研究，因此，本研究將膝三臟湯粗液用不同工藝進(jìn)行提取純化，將提取物再次作用于大鼠KOA模型并比較其藥效，以期明確膝三臟湯的主要藥效部位，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 SPF級健康Wistar大鼠70只，體質(zhì)量（250±10）g，雌雄各半，由佛山大學(xué)體育運動實驗中心代購。實驗動物合格證號：SCXK（粵）2013-0034。按照隨機(jī)數(shù)字表將70只大鼠分為7組，即空白組、模型組、美洛昔康組、膝三臟湯—石油醚組、膝三臟湯—氯仿組、膝三臟湯—乙酸乙酯組、膝三臟湯—正丁醇組，每組10只。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，7組動物在實驗前其性別、體質(zhì)量均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

1.2 藥物、試劑與儀器 膝三臟湯中藥組成：熟地黃20 g、吳茱萸8 g、黨參10 g、山藥15 g、茯苓20 g、白術(shù)15 g、續(xù)斷15 g、黃芪20 g、牛膝10 g、杜仲15 g、當(dāng)歸15 g、骨碎補15 g、補骨脂15 g、甘草10 g。上述中藥材由廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供。美洛昔康片，規(guī)格為每片7.5 mg，由揚子江藥業(yè)生產(chǎn)，批號為8090941。白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6，腫瘤壞死因子（TNF）-α酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；TRAPeze ELISA端粒酶檢測試劑盒（德國Boehringer-mannheim公司）；水合氯酸（天津科密歐化學(xué)試劑公司）；注射用青霉素鈉（哈藥集團(tuán)）；硫酸慶大霉素注射液（河南天方藥業(yè)）。Sunrise酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；慕絲線（強生公司）。

1.3 藥物制備 ①膝三臟湯不同工藝提取物制備方法：將按膝三臟湯處方比例的中藥材置入超聲儀中，加10倍量水浸泡1 h后，煎煮1 h，濾出煎液。濾渣加入8倍量水煎煮1 h，合并煎液。再以1∶8的比例加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液，蓋上蓋子，浸泡20 min。然后開啟超聲儀30 min，棄去藥渣，得到提取液，將其置入分液漏斗并加入200 mL蒸餾水制成混懸液，然后依次用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每組重復(fù)3次，依次得到相應(yīng)提取物。②美洛昔康混懸液：每片溶于25 mL生理鹽水中，制備成0.3 mg/mL的混懸液。

1.4 造模 實驗動物喂養(yǎng)1周適應(yīng)新環(huán)境后，采用改良Hulth法[6]行右膝造模。術(shù)前備皮、禁食禁水，給予大鼠腹腔注射10%水合氯醛（劑量為0.35 mL/100 g）麻醉。將大鼠仰臥固定，絡(luò)合碘消毒、鋪巾，取右膝內(nèi)側(cè)緣縱行切口，極度屈曲、外翻膝關(guān)節(jié)，暴露關(guān)節(jié)間隙后依次切斷前交叉切帶、去除內(nèi)側(cè)半月板、保留軟骨面，沖洗后給予8萬U的硫酸慶大霉素關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，后逐層縫合切口?；贾话?、不固定。術(shù)后青霉素肌肉注射抗炎3 d。術(shù)后碘伏消毒7 d，早晚各1次。16周后，KOA大鼠模型造模成功[6]。

1.5 給藥 造模成功后，膝三臟湯—石油醚組、膝三臟湯—氯仿組、膝三臟湯—乙酸乙酯組、膝三臟湯—正丁醇組分別給予膝三臟湯石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物（劑量均為10 mL/kg）灌胃。美洛昔康組給予美洛昔康混懸液（劑量為3 mg/kg）灌胃?？瞻捉M、模型組給予等體積蒸餾水灌胃。每天2次，給藥6周后進(jìn)行取樣檢測。

1.6 指標(biāo)檢測與方法

1.6.1 取材 ①取血：腹主動脈取血，在室溫下靜置1 h。待血液凝固以3 000 r/min 4℃離心10 min。將血清移至EP管中，于4℃冰箱中保存待測。②膝關(guān)節(jié)軟骨：取大鼠雙膝脛骨平臺軟骨，一側(cè)軟骨用福爾馬林溶液固定48 h后送檢，另一側(cè)軟骨利用分析天平稱濕質(zhì)量。鼓風(fēng)加熱機(jī)以60℃加熱關(guān)節(jié)軟骨，12 h后取出，采用同一天平稱取干質(zhì)量。

1.6.2 采用雙抗體夾心ELLSΑ法測定血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量 具體操作步驟按IL-1、IL-6、TNF-α ELLSΑ試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6.3 軟骨含水率測定 取雙側(cè)股骨髁軟骨。按以下公式計算：軟骨含水率=[（軟骨濕質(zhì)量-軟骨干質(zhì)量）/軟骨濕質(zhì)量]×100%。

1.6.4 采用TRAPeze-ELISA法檢測軟骨端粒酶活性 給藥結(jié)束后24、48、72 h采用TRAPeze-ELISA法分別檢測端粒酶活性。按照參考文獻(xiàn)[7-9]所述方法進(jìn)行端粒酶組織提取液的制備及測定，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。用雙波長酶標(biāo)儀測定反應(yīng)液450 nm處的吸光度（D）值（對照波長為690 nm），以二者之差ΔD[D（450 nm）-D（690 nm）]來判斷端粒酶陽性[9]：ΔD＜0.2為陰性，ΔD≥0.2為陽性。以試劑盒所自帶的標(biāo)準(zhǔn)Hela細(xì)胞株提取物作為陽性對照，以陽性標(biāo)本95℃滅活10 min的標(biāo)本作為陰性對照。

1.7 統(tǒng)計方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析。進(jìn)一步兩兩比較，若滿足正態(tài)性、方差齊性，用LSD法檢驗；若滿足正態(tài)性，不滿足方差齊性，則采用Dunnett T3檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膝三臟湯不同提取物對KOA大鼠炎癥因子含量的影響 表1結(jié)果顯示：模型組大鼠血清炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α含量較空白組明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，各膝三臟湯提取物組、美洛昔康組大鼠血清炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α含量均降低，其中：乙酸乙酯組IL-1、TNF-α含量明顯低于氯仿組、正丁醇組（P＜0.05），與石油醚組、美洛昔康組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；乙酸乙酯組IL-6含量低于石油醚組、正丁醇組（P＜0.05），與氯仿組、美洛昔康組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示膝三臟湯石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物可改善KOA大鼠炎癥水平，且膝三臟湯—乙酸乙酯組的降低程度較為明顯。

表1 膝三臟湯不同提取物對KOA模型大鼠炎癥因子的影響Table 1The effect of different KTD extracts on serum inflammatory cytokines in KOA rats[-x±s，ρ/（pg·mL-1）]

2.2 膝三臟湯不同提取物對KOA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨含水率的影響 表2結(jié)果顯示：模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨含水率較空白組升高（P＜0.05）。與模型組比較，各膝三臟湯提取物組、美洛昔康組大鼠關(guān)節(jié)軟骨含水率均明顯降低，其中：乙酸乙酯組大鼠關(guān)節(jié)軟骨含水率低于石油醚組、正丁醇組（P＜0.05），與氯仿組、美洛昔康組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示膝三臟湯石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物可改善KOA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織成分，且膝三臟湯—乙酸乙酯組的降低程度較為明顯。

表2 膝三臟湯不同提取物對KOA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨含水率的影響Table 2 The effect of different KTD extracts on the moisture content in articular cartilage in KOA rats(-x±s)

2.3 膝三臟湯不同提取物對KOA模型大鼠軟骨端粒酶活性的影響 表3結(jié)果顯示：模型組大鼠軟骨端粒酶活性較空白組升高（P＜0.05）。與模型組比較，各膝三臟湯提取物組、美洛昔康組大鼠軟骨端粒酶活性均明顯降低，其中：乙酸乙酯組大鼠軟骨端粒酶活性均低于氯仿組、正丁醇組（P＜0.05），與石油醚組、美洛昔康組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示膝三臟湯石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物可改善KOA模型大鼠軟骨老化情況，且膝三臟湯—乙酸乙酯組的降低程度較為明顯。

3 討論

因復(fù)方湯液是多種有效成分及無效成分組合的集合體，故本研究在既往膝三臟湯復(fù)方湯劑（粗液）研究的基礎(chǔ)上，采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇4種溶劑對膝三臟湯的有效成分進(jìn)行提取，觀察其對KOA模型大鼠模型的作用效果，初步分析和評價膝三臟湯不同工藝提取物的功能活性和潛力。

表3 膝三臟湯不同提取物對KOA模型大鼠軟骨端粒酶活性的影響Table 3 The effect of different KTD extracts on cartilaginous telomerase activity in KOA rats (-x±s)

KOA為膝關(guān)節(jié)的一種無菌性炎癥。IL-1、IL-6、TNF-α是參與KOA的重要致炎性細(xì)胞因子，由單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生。軟骨細(xì)胞表面由于有高水平IL-1受體的存在，致使軟骨膠原表型改變，使之更易被基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）消化[10-12]，表明IL-1可加快軟骨細(xì)胞凋亡。IL-6在骨關(guān)節(jié)炎的全層軟骨及滑膜中呈現(xiàn)過量表達(dá)[13]，提示1L-6與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有一定的關(guān)系。IL-6還通過自分泌形式作用于軟骨細(xì)胞，進(jìn)而影響軟骨細(xì)胞正常增殖[14]。TNF-α在KOA的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，它不僅能破壞關(guān)節(jié)軟骨、降解軟骨基質(zhì)，還促進(jìn)炎癥進(jìn)一步發(fā)展。有研究表明，TNF-α對骨質(zhì)及關(guān)節(jié)軟骨破壞的主要原因是通過增加MMP的表達(dá)及活性[15，16]，進(jìn)而增強炎性細(xì)胞的破壞力[17]，TNF-α還能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞向成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使滑膜組織發(fā)生纖維性病變，促進(jìn)滑液中細(xì)胞因子異常升高，增加骨和軟骨的破壞[18]。本研究結(jié)果顯示，膝三臟湯石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物均可降低KOA模型大鼠炎癥因子IL-1、IL-6及TNF-α含量，表明其對膝骨性關(guān)節(jié)的局部炎癥因子釋放均有抑制作用；但是不同工藝提取物的作用程度不同，數(shù)據(jù)顯示，乙酸乙酯提取物對炎癥因子的降低程度較其他提取物更為明顯。

端粒是位于真核細(xì)胞的染色體末端的DNA重復(fù)序列，它對染色體具有保護(hù)作用，是調(diào)控因子中的重要成分，與細(xì)胞周期調(diào)控因子相互作用可導(dǎo)致細(xì)胞老化[19]。多數(shù)情況下，常因端粒酶的活性降低，端粒在復(fù)制分裂過程中逐漸失去堿基對，致使端粒逐漸縮短，細(xì)胞發(fā)生老化、凋亡[20]。KOA軟骨細(xì)胞的凋亡與細(xì)胞的端粒長度、端粒酶活性密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，膝三臟湯石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物對端粒酶活性均有明顯的抑制作用，但乙酸乙酯提取物抑制端粒酶活性的作用程度較其他提取物更為明顯。

綜上所述，膝三臟湯乙酸乙酯提取物可明顯抑制KOA大鼠模型血清炎癥因子IL-1、IL-6及TNF-α的釋放，并可降低關(guān)節(jié)軟骨的含水率，對端粒酶的活性有一定的調(diào)控作用。本研究結(jié)果提示：在同一生藥量前提下，膝三臟湯被乙酸乙酯溶劑提取出來的主要藥效成分的部分生物活性作用較膝三臟湯石油醚、氯仿、正丁醇提取物強。但其提取物的毒理作用及具體成分、結(jié)構(gòu)尚不清楚，有待下一步進(jìn)行深入研究以分析確定。