針刺療法調(diào)節(jié)IBS-D大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和促進(jìn)腸緊密連接的作用研究

李湘力， 蔡敬宙， 林泳， 劉小寧

（1.廣州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科，廣東廣州 510180；2.廣州市第一人民醫(yī)院消化科，廣東廣州 510180）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種非器質(zhì)性因素的胃腸功能紊亂性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有腸易激癥狀的人群占全球人口的5%～20%。而我國以腹瀉型腸易激綜合征（irritable bowel syndrome with diarrhea，IBS-D）為主[1]。近年來國內(nèi)外研究不但發(fā)現(xiàn)針灸對改善IBS癥狀有顯著作用[2]，而且利用16 s高通量測序技術(shù)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)針灸能改變IBS患者腸道菌群結(jié)構(gòu)[3]，但針灸對IBS-D腸道菌群改變特征以及可能的分子生物學(xué)機(jī)制認(rèn)識(shí)仍然有限。本研究利用Wistar大鼠建立IBS-D模型，以針刺穴位為干預(yù)手段，選用匹維溴銨作為陽性對照藥物，觀察針刺對IBS-D的緩解作用，并采集糞便行16 s高通量測序分析腸道菌群變化，進(jìn)一步研究差異菌群對腸上皮緊密連接ZO-1和Occludin的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

Wistar大鼠48只，SPF級，雄性，4周齡，體質(zhì)量100～120 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（粵2013-0002），飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF屏障系統(tǒng)，采用12 h∶12 h晝夜間斷照明。實(shí)驗(yàn)全程依據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)要求開展。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組和針刺組，共4組，每組各12只。

1.2 主要儀器與試劑

Illumina技術(shù)測序平臺(tái)（北京諾禾致源股份有限公司）；熒光定量PCR儀（qTower 2.0德國耶拿公司）；0.30 mm×10 mm華佗牌一次性無菌針灸毫針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；匹維溴安片（法國Abbott Healthcare SAS，批號(hào)：H20120127）；糞便DNA提取試劑盒（德國Qiagen DNA Stool Minikit，批號(hào)：51504）；RNAiso Plus試劑盒（日本Takara公司，批號(hào)：D9108A）；Real-time PCR相關(guān)試劑盒（上?；鶢栴D生物科技有限公司，批號(hào)：RR420）；引物合成（上海生工生物工程股份有限公司）；相關(guān)ZO-1/Occludin抗體（美國Abcam公司，批號(hào)：ab221547/ab216327）。

1.3 模型制備

參照文獻(xiàn)[4]方法制備IBS-D大鼠模型。將Wistar大鼠通宵光照12 h后，置于45℃環(huán)境溫度中刺激5 min，然后剝奪飲水24 h；再置于4℃低溫環(huán)境中3 min，給予夾鼠尾刺激1 min；接著水平振動(dòng)120次/min，連續(xù)刺激40 min；剝奪食物24 h，持續(xù)3周，獲得IBS-D大鼠模型。

1.4 干預(yù)方法

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 觀察大鼠排便粒數(shù)并計(jì)算糞便含水量

在造模前、造模3周、治療2周后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)于各組籠內(nèi)墊清潔濾紙，計(jì)算8∶00AM-12∶00AM大鼠糞便粒數(shù)并稱質(zhì)量，干燥放置24 h再稱質(zhì)量，計(jì)算糞便含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%[5]。

1.5.2 大鼠糞便菌群16 s測序

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取結(jié)腸內(nèi)糞便1～2顆，采用Qiagen DNA Stool Minikit提取并純化糞便菌群DNA，行瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，合格樣品于Illumina技術(shù)測序平臺(tái)型菌群測序分析，測序區(qū)域見表1。將相似度＞97%的序列Tag歸類為同一OUT并根據(jù)眾數(shù)原則對每個(gè)OUT行不同水平物種注釋，利用QIIME 1.8.0軟件計(jì)算樣品物種多樣性，Alpha多樣性以Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)顯示。統(tǒng)計(jì)不同水平OUT聚類情況，并分析相對豐度，對門水平和科水平進(jìn)行討論。

表1 細(xì)菌16 s測序區(qū)域Table 1 Bacterial 16 s sequencing area

1.5.3 Real-time PCR檢測ZO-1、Occludin基因表達(dá)水平

取末端結(jié)腸按RNAiso Plus說明書提取RNA，然后行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；Real-time PCR反應(yīng)按以下程序兩步法擴(kuò)增：（1）預(yù)變性95℃，1 min，循環(huán)1次；（2）變性、退火延伸（95℃ 15 s，60℃ 30 s采集熒光），循環(huán)40次；反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)融解曲線和擴(kuò)增曲線，采用2-ΔΔCt方法分析Ct值并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算ZO-1和Occludin基因的mRNA表達(dá)量，引物序列見表2。

表2 引物序列信息Table 2 Primer sequence information

1.5.4 免疫組化法檢測ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)

結(jié)腸組織固定于4%多聚甲醛固定液中，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，石蠟中浸蠟和包埋，切片2.5 μm厚。65℃烤片1 h；室溫二甲苯和梯度乙醇脫蠟；抗原修復(fù)，將配好的枸櫞酸鹽加入高壓鍋內(nèi)，先將液體煮沸，放入玻片高壓修復(fù)3 min，冷水緩慢冷卻高壓鍋后洗滌；3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶；血清封閉非特異性抗原；室溫孵育一抗1 h后4℃濕盒中過夜；37℃復(fù)溫30 min，吸走一抗后洗滌；37℃孵育二抗30 min后洗滌，DAB顯色，鏡下觀察染色情況，適時(shí)終止；蘇木素復(fù)染后洗滌；各級酒精脫水和二甲苯浸泡透明，中性樹脂封片。

1.表示反詰語氣，這種句子是用疑問句的形式表達(dá)肯定意思。可譯為“嗎”或“呢”。[4]203共6例。如：

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Graphad Prism 6.0和Adobe Illustrator CS5軟件分析繪圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)分布及方差齊性后采用兩樣本t檢驗(yàn)分析；相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)進(jìn)行分析；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠排便粒數(shù)和性狀評價(jià)

表3結(jié)果顯示：造模前，各組大鼠排便粒數(shù)和糞便含水量無明顯差異（P＞0.05）；造模3周時(shí)，與正常組比較，模型組大鼠排便粒數(shù)和糞便含水量均明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療2周后，與模型組比較，針刺組大鼠排便粒數(shù)明顯減少、糞便含水量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示針刺能有效改善IBS-D大鼠腹瀉癥狀。

表3 各組大鼠糞便含水量及糞便粒數(shù)比較Table 3 Comparison of fecal water content and pellet number of feces of rats in various groups (-x±s)

2.2 各組大鼠糞便菌群多樣性比較

圖1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組菌群α-多樣性顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組菌群豐度顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示針刺治療能有效增加IBS-D大鼠菌群多樣性，療效與西藥組相似。

圖1 各組大鼠腸道菌群α-多樣性Figure 1 Comparison of α-diversity of gut flora in various groups

2.3 各組大鼠糞便菌群構(gòu)成比較

圖2 基于OUT聚類的細(xì)菌相對豐度Figure 2 Relative abundance of gut microbiota based on OUT clustering

圖2 結(jié)果顯示：基于OUT聚類結(jié)果，對各組大鼠糞便樣品不同水平的菌群相對豐度進(jìn)行分析。門水平顯示IBS-D大鼠厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度顯著下降，變形菌門（Proteobacteria）相對豐度顯著升高；進(jìn)一步分析科水平菌群相對豐度差異，提示IBS-D大鼠乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）和雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）相對豐度顯著下降，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）相對豐度顯著升高。針刺組能糾正上述菌群失衡，促使菌群結(jié)構(gòu)趨于正常。

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織緊密連接基因ZO-1和Occludin表達(dá)情況

圖3 各組大鼠結(jié)腸ZO-1和Occludin mRNA水平表達(dá)量比較Figure 3 Comparison of mRNA expression levels of ZO-1 and Occludin in various groups

圖3 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織緊密連接基因ZO-1和Occludin表達(dá)量明顯下降（P＜0.05）；治療后，針刺組ZO-1和Occludin表達(dá)量顯著提升，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且ZO-1表達(dá)量較Occludin表達(dá)量升高更加明顯。圖4和圖5免疫組化結(jié)果顯示：正常組、西藥組、針刺組3組ZO-1和Occludin兩種蛋白沿大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞膜頂端呈整齊線狀分布，棕褐色信號(hào)較強(qiáng)。而模型組陽性染色明顯減弱，ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)紊亂，呈非連續(xù)性，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示針刺治療能上調(diào)大鼠結(jié)腸上皮緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)，其上調(diào)水平與西藥組基本一致。

2.5 針刺組緊密連接蛋白表達(dá)與差異菌群相關(guān)性

表5結(jié)果顯示：針刺組ZO-1和Occludin的表達(dá)量與乳酸桿菌科、雙歧桿菌科的相對豐度呈顯著正相關(guān)，與腸桿菌科無相關(guān)性。

圖4 大鼠結(jié)腸ZO-1和Occludin的表達(dá)（免疫組化，×100）Figure 4 Comparison of expression of ZO-1 and Occludin in rat colon of various groups（by immunohistochemistry，×100）

圖5 各組大鼠結(jié)腸ZO-1和Occludin免疫組化表達(dá)量比較Figure 5 Comparison of immunohistochemical expression quantity of ZO-1 and Occludin in rat colon of various groups

表5 針刺組緊密連接蛋白表達(dá)與差異菌群的相關(guān)性Table 5 Correlation coefficient between tight junction protein expression and differential bacteria at family level

3 討論

腸易激綜合征（IBS）是我國胃腸病門診常見的病種，由于其病情反復(fù)、服藥療程長，給患者和家庭帶來嚴(yán)重困擾。目前，IBS的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，是一種涉及腸道菌群、胃腸動(dòng)力、內(nèi)臟異常敏感、精神心理等多因素的疾病[6]。隨著高通量測序的發(fā)展，研究[7]發(fā)現(xiàn)IBS患者腸道菌群多樣性下降，其中，腹瀉型IBS（IBS-D）較便秘型IBS（IBS-C）的腸道菌群改變更顯著，表現(xiàn)為變形菌門豐度增加，優(yōu)勢菌群豐度下降為特征的菌群改變。

基于腸道菌群在IBS發(fā)生發(fā)展中的重要作用，西醫(yī)常以口服益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群為治療手段。但作為外源性補(bǔ)充的益生菌，存在定植困難、停藥后復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)。隨著中醫(yī)針灸的發(fā)展，國內(nèi)外越來越多研究表明，針灸對IBS-D的療效顯著，并且在調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)方面具有重要作用[8，9]。國內(nèi)學(xué)者回顧針灸對腸道菌群影響的相關(guān)研究，其中涉及手針、電針和艾灸等多元化的針灸方法，在不同疾病種類、選穴和治療時(shí)間的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)針灸療法具備以上調(diào)乳酸桿菌、雙歧桿菌為特征的腸道菌群調(diào)節(jié)作用[3]。結(jié)合本研究結(jié)果，針刺治療組的排便顆粒、糞便含水量顯著下降，腸道菌群改變較口服匹維溴銨更為明顯，有效地下調(diào)了含較多致病菌的變形菌門的相對豐度；進(jìn)一步分析科水平菌群結(jié)構(gòu)變化，乳酸桿菌科和雙歧桿菌科豐度均顯著上升，腸桿菌科豐度顯著下降，此與國內(nèi)外針灸介導(dǎo)腸道菌群結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果類似。

緊密連接蛋白是位于腸上皮相鄰細(xì)胞鏈接頂側(cè)面的蛋白復(fù)合體，其中膜周蛋白ZO-1和跨膜蛋白Occludin是重要的骨架蛋白，腸上皮緊密連接保持了上皮屏障的完整性，并能調(diào)節(jié)上皮屏障選擇性的通透作用，是維持黏膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要蛋白[10]。研究[11]表明，ZO-1的表達(dá)下降，不僅是潰瘍性結(jié)腸炎的始動(dòng)因素之一，在IBS-D患者的腸黏膜組織中，也發(fā)現(xiàn)不同程度的下降。而腸內(nèi)益生菌如乳酸桿菌、雙歧桿菌的相對豐度上升，能上調(diào)腸上皮緊密連接蛋白的表達(dá)[12，13]。本研究中，IBS-D模型組mRNA水平和蛋白水平的ZO-1、Occludin表達(dá)量明顯下降，經(jīng)針刺治療后，二者表達(dá)量顯著增高。分析結(jié)果顯示針刺治療IBS-D模型大鼠結(jié)腸組織的緊密連接蛋白表達(dá)量與乳酸桿菌科和雙歧桿菌科的相對豐度呈顯著正相關(guān)。

本研究以針刺治療改變IBS-D的腸道菌群結(jié)構(gòu)為切入點(diǎn)，進(jìn)一步研究了結(jié)合相對豐度顯著增加的菌群與腸上皮緊密連接的相關(guān)性，探究針刺治療改變菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響腸屏障功能的可能。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針刺后IBS-D模型大鼠腸道菌群的α-多樣性上調(diào)，主要菌門構(gòu)成比發(fā)生改變，有效地糾正了IBS-D模型大鼠菌群多樣性下降和變形菌門過度增長為特點(diǎn)的菌群紊亂。同時(shí)驗(yàn)證了腸上皮細(xì)胞ZO-1、Occludin等緊密連接蛋白的表達(dá)量與差異菌群顯著相關(guān)。從中醫(yī)角度而論，IBS-D并無特定病名，常歸于“郁證”、“泄瀉”論之，具有病位在腸，涉及肝、脾、腎三臟的特點(diǎn)[14]，利用目前的IBS-D臨床文獻(xiàn)，采用傳統(tǒng)辨證與聚類法分析10余種證型，眾多醫(yī)家認(rèn)為“肝郁脾虛、肝脾失和”是引起IBS-D的主要病機(jī)之一，“飲食不節(jié)、情志失調(diào)”為其重要病因[15，16]。本研究采用針刺治療，選穴為天樞、大橫、足三里、上巨虛、太沖和百會(huì)穴。天樞乃足陽明胃經(jīng)的要穴，也是大腸之募穴，能通調(diào)腸腑、條暢氣機(jī)；大橫為足太陰脾經(jīng)穴位，具有健脾利水濕的作用；足三里合治六腑，是健脾益胃最有效的穴位；上巨虛是大腸下合穴，可治一切腸道疾患；太沖屬足厥陰肝經(jīng)之原穴，且經(jīng)絡(luò)循行至巔頂額部，配合督脈之百會(huì)穴。二者既可疏肝理氣、化生氣血，更可調(diào)理情志[17，18]；諸穴配伍行針，從病因、病機(jī)出發(fā)，可有效緩解IBS-D的臨床癥狀，而本研究更補(bǔ)充證明針刺可以上調(diào)腸內(nèi)益生菌豐度，可作為單純口服外源性益生菌調(diào)整腸道菌群的替代方案，具備從整體、從根本論治，施術(shù)時(shí)間短，毒副作用少、無藥物依賴等優(yōu)勢。

綜上所述，筆者推測針刺治療除具備疏肝健脾、理氣調(diào)神等功效，還能通過上調(diào)IBS-D菌群多樣性及益生菌相對豐度和介導(dǎo)ZO-1、Occludin等緊密連接蛋白表達(dá)，從而達(dá)到改善IBS-D癥狀的功能，并能一定程度上替代目前西醫(yī)常用治療方案。然而，腸道菌群改變與IBS互為因果，本研究中菌群改變與緊密連接蛋白的表達(dá)間的始動(dòng)關(guān)系，仍需要進(jìn)一步深入研究。針灸作為一種治療方法，不同穴位的選擇、治療時(shí)間的改變，對疾病的治療效果也不盡相同，需要更多的研究提供客觀依據(jù)。