奶牛場口蹄疫免疫預防技術

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性且能快速遠距離傳播的動物疫病?？谔阋吣芨腥矩i、牛、羊等主要經濟動物和野生偶蹄動物，易感動物多達70余種。發(fā)病動物的主要癥狀是精神沉郁、流涎、跛行、臥地，在其口鼻部、蹄部和母畜乳部等無毛部位發(fā)生水皰，水皰破裂后形成潰瘍和瘢痂。口蹄疫的發(fā)病率高，但大部分成年家畜可耐過。幼畜則經常不見癥狀而死，死亡率因病毒的毒力不同而有差異，嚴重時可達100%。口蹄疫可造成巨大經濟損失和社會影響。該病是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）法定報告的動物傳染病之一。我國于2005年5月24日，中國農業(yè)部發(fā)布的《動物病原微生物分類名錄》（農業(yè)部第53號公告）中，將口蹄疫病毒列為一類動物病原微生物。口蹄疫也是《中華人民共和國進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》中進境動物必須檢疫的一類傳染病。

一、口蹄疫病毒（FMDV）

口蹄疫病毒屬微RNA病毒科的口瘡病毒屬（包括4種病毒，即牛鼻病毒A、牛鼻病毒B、馬鼻病毒A和口蹄疫病毒），口蹄疫病毒為典型代表毒株，也是人類確認的第一個動物病毒病原，開創(chuàng)了病毒學新紀元，是研究最深入的動物病毒之一。

1.口蹄疫病毒結構。電子顯微鏡觀察，口蹄疫病毒顆粒呈圓形，表面光滑，直徑為27～30nm（圖1）。病毒粒子無囊膜，呈二十面體對稱，由蛋白衣殼包裹基因組RNA組成核衣殼。采用X線晶體衍射技術對多個血清型病毒衣殼的精細結構進行了解分析，衣殼由60個VP1、VP2、VP3和VP4分子組成，其中VP1～VP3位于病毒粒子表面，VP4位于內部，并有一個十四烷基共價鍵連接到其氨基端。表面結構蛋白VP1、VP2和VP3立體結構相似，是由8個鏈狀β折疊桶（βB、βC、βD、βE、βF、βG、βH、βI）組成（圖1-a），β折疊桶之間由表面環(huán)結構所連接，表面環(huán)含有病毒重要的表位。例如，VP1的βG和βH之間的GH環(huán)含有口蹄疫病毒最重要的抗原位點和識別整合素受體的RGD基序。VP1、VP2、VP3和VP4各一個分子組成一個原粒（圖1-b,e），相對沉降系數為5S，分子量約為8000ku，5個原粒組成一個五聚體（圖1-c,f），相對沉降系數為14S，浮密度為1.5g/mL，分子量為3.8×106ku，12個五聚體構成完整病毒衣殼。自然培養(yǎng)或采用基因工程方法可以獲得口蹄疫病毒樣顆粒，不含核酸RNA，由VP1、VP3和 VP0（VP2和 VP4前體）組成，沉降系數為75S，分子量為47×106ku。病毒基因組由大約8400個核甘酸組成，為正鏈單股RNA分子。病毒衣殼和基因組共同組成完整病毒粒子（圖1-d,g），其表面不像其他微RNA病毒科成員有許多參與病毒——受體結合的溝或谷，而是相對比較光滑的球面，表面有一細小的環(huán)狀或纖突突起，五重軸中心點有一個小孔，可以允許小分子進入病毒顆粒，如二乙烯亞胺（BEI）、氯化銫等可以進入病毒顆粒。完整病毒粒子蔗糖密度梯度中的相對沉系數為146S，分子量為8.08×106ku，完整病毒顆粒146S（滅活疫苗的抗原）或75S空殼在酸性、堿性或一定溫度條件下降解為12S和5S粒子，降解后小分子（12S、5S）無免疫原性。

2.口蹄疫病毒的分類。血清型：1922-1953年，德、英、法三國學者發(fā)現并命名了口蹄疫病毒的7個血清型即 O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型。至20世紀80年代后期已經確定了70～80多個亞型，其中O型有10～11個血清亞型，A型大約有32個血清亞型，C型有5個血清亞型，Asia1型有3個血清亞型。隨著新毒株的不斷出現，亞型分類越來越混亂，現已放棄亞型分類，采用拓撲型分類。拓撲型：在Rico-Hesse脊髓灰質炎病毒基因分型的基礎上，根據變異度最大的VP1核酸序列，將同一血清型中關系密切的一組病毒分為不同拓撲型，拓撲型毒株具有明顯的地域性。目前O型口疫病毒有10個拓撲型，A型有3個拓撲型、C型有8拓撲型、亞洲1型有1個拓撲型，SAT1、SAT2和SAT3分別有3、2和3個拓撲型。我國曾經流行過的有O、A和亞洲1三個型，2018年7月1日亞洲1型退出免疫之后，主要流行毒株為O型和A型，其中O型的流行毒株有三個拓撲型——東南亞拓撲型（如O/Mya98/BY/2010等）、中東-南亞拓撲型又叫泛亞拓撲型（如O/Ind2001等）和古典中國拓撲型（如O/GX/09-7等）。A型的流行毒株只有一個拓撲型及東南亞拓撲型（如A/Sea-97/G2 等）。

3.口蹄疫病毒的易感動物及感染特點。口蹄疫的易感動物種類繁多。重要家畜如豬牛、羊等都易感，其中牛的發(fā)病率幾乎達100%，其次是豬，再次是羊及20多科70多種野生動物。

口蹄疫病毒變異性極強，其7個血清型之間不能產生交叉免疫，因此防治口蹄疫相當于防治7種不同的傳染病。同型內不同病毒株的抗原性也有差異，而新毒株又不斷出現，每出現一種新毒株，疫情就出現一次新高潮。

口蹄疫病毒的感染性和致病力特別強。如一頭牛只要吸入10個感染單位的病毒就可發(fā)病，而病畜的排毒量又特別大，一頭病豬每天僅從呼吸道排出的病毒就高達108個感染單位。一頭病豬一天呼出的病毒可使1000萬頭牛發(fā)病。

口蹄疫有多種傳播方式和感染途徑。該病不但可通過與病畜接觸傳播，還可通過空氣傳播。若氣象條件合適，病毒可向下風方向傳播幾十甚至上百公里的距離。

口蹄疫的潛伏期短，發(fā)病急。動物感染口蹄疫病毒后最快十幾小時就可排毒，處于潛伏期的動物、發(fā)病動物及持續(xù)感染動物均可引起易感動物發(fā)病。

動物機體對口蹄疫病毒的免疫應答程度較低。免疫注射動物，甚至發(fā)病后康復動物，再次受到同源病毒攻擊時只保持不再發(fā)病，其免疫系統不能完全抵抗病毒感染。

二、奶牛發(fā)病時的臨床癥狀

在所有易感動物中奶牛最易感染口蹄疫病毒，感染后臨床表現十分明顯，以口腔和蹄部出現水皰為主要特征。牛群一旦感染口蹄疫病毒，傳染速度很快，出現相同癥狀的病牛數量急劇增加。牛自然感染口蹄疫病毒時，潛伏期一般為2～14d，但是，隨著環(huán)境的變化，潛伏期亦可縮短或延長。

患病初期，病牛出現急性發(fā)熱，體溫可以升高至40～41.5℃，稽留1～4d。伴隨精神沉郁、脈博加快、黏膜潮紅、反芻減弱和產奶量下降等癥狀。牛感染24h后出現病毒血癥，在病毒血癥期間，從多數組織中可檢測到病毒，其中蹄叉、蹄冠部和舌上皮組織中的病毒含量最高。

病牛蹄部病變主要發(fā)生在蹄叉、蹄冠及蹄踵和趾間隙的柔軟皮膚，初期表現局部有熱感、紅和疼痛，之后形成小水皰，繼而融合為較大的水皰。水皰破潰時水液排出形成糜爛，其表皮常不完全脫落而干燥形成硬痂，有時蹄冠部發(fā)生多處水皰，互相連接融合，引起蹄冠與蹄緣分離，病愈后較長時間內，仍留有明顯的縫隙和痕跡，病牛因蹄部疾患常常舉步艱難。蹄部水皰破潰后，若護理良好、保持清潔干燥，經10～14d可以自愈，否則病程很長，嚴重時，蹄匣脫落。

在蹄部發(fā)生水皰的稍前或同時，出現口腔病變，一般是在舌背面出現環(huán)形、粗糙的白色隆起，隨著液體的積聚，隆起增大，有時多個水皰相互融合，凸現于正常的舌面組織使舌面凹凸不平。牛流出大量泡沫樣口涎，并掛滿口角與下唇。水皰破裂后，舌面露出紅色爛斑。病牛多因口腔疼痛不能吃草而日漸消瘦。水皰也會出現在齒齦、舌面、鼻鏡、唇內、鼻前端及眼結膜等處，水皰一般較小，為綠豆或指頭蛋大小，破裂后形成局限性小爛斑。

泌乳牛感染口蹄疫時，乳頭皮膚亦可出現水皰。口蹄疫還會引起懷孕母牛流產、死胎或分娩出帶病毒的犢牛。此外，病變也見于鼻咽部、食道和瘤胃，亦見于母牛陰道基膜和公牛陰囊皮膚。成年發(fā)病牛的死亡率通常比較低，而發(fā)病犢牛死亡率高。新生牛呈急性經過而不形成水皰性病損，經過1～2d，因心肌炎而死亡。

成年病牛一般1～2周后即可痊愈，部分病例由于繼發(fā)細菌感染，使病變過程復雜化，口腔出現深層潰瘍、壞死和膿腫，并可能發(fā)展為咽炎、支氣管炎，肺水腫和肺氣腫；蹄冠部化膿，出現壞死性蜂窩織炎，發(fā)生感染的關節(jié)與腱鞘松弛，有時伴隨敗血癥而導致病牛死亡。部分病?？祻秃螅赡馨l(fā)生繼發(fā)癥，表現為精神沉郁，食欲減退，換毛過程停滯，奶產量降低。有些病牛出現心肺性喘息和咳嗽，心博減弱，脈博無力，心悸亢進和心律不齊，瘤胃蠕動減弱，有時出現抽搐興奮或精神沉郁。

三、口蹄疫免疫技術

目前，我國政府批準用于預防口蹄疫的疫苗包括單價、雙價或三價滅活油佐劑疫苗、合成肽疫苗及基因工程亞單位疫苗。其中合成肽疫苗僅用于豬口蹄疫的防控，基因工程亞單位疫苗因其抗原分子量小、免疫原性弱而未能大面積推廣使用。滅活疫苗因效果良好而且質量穩(wěn)定，是當前乃至今后畜牧業(yè)生產中預防口蹄疫的主要疫苗。

1.疫苗選擇。2018年7月1日，我國宣布亞洲1型口蹄疫退出免疫，目前至今后主要用于牛羊的口蹄疫疫苗有以下幾種。

1）?？谔阋逴型、A型雙價滅活疫苗。O型、A型病毒，滅活前的病毒含量分別至少107.0TCID50/mL，用于預防牛、羊O型、A型口蹄疫。注射后15d產生免疫力，免疫期為6個月。牛、羊深部肌內注射，6月齡以上牛4mL/頭，6月齡以下牛和1歲以上羊2mL/頭，6月齡以下的羊1mL/只。

2）口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗（O/MYA98/BY/2010株+Re～A/WH/09株）。本品系用口蹄疫病毒O型O/MYA98/BY/2010株、重組A型Re～A/WH/09毒株分別接種BHK～21懸浮細胞，收獲細胞培養(yǎng)物，分別經濃縮純化、二乙烯亞胺（BEI）滅活后與ISA206佐劑按比例混合乳化制成疫苗。用于預防牛、羊O型和A型口蹄疫，免疫期為6個月，肌肉注射，牛1mL/頭，羊0.5mL/只。

3）口蹄疫（A型）滅活疫苗（AF/72株）。本品系用牛源A型口蹄疫病毒AF/72株細胞毒，接種BHK-21細胞，通過濃縮培養(yǎng)法培養(yǎng)，收獲細胞培養(yǎng)物，經二乙烯亞胺（BEI）滅活后，加礦物油佐劑混合乳化制成。用于預防牛A型口蹄疫，免疫期為6個月，肌肉注射，6月齡以上成年牛2.0mL/頭，6月齡以下犢牛1.0mL/頭。

4）口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗（O/HB/HK/99株+AF/72株）。本品含滅活的口蹄疫O型（O/HB/HK/99株 ）、A型（AF/72株 ） 病毒，滅活前的病毒含量分別至少為107.0TCID50/mL。用于預防牛口蹄疫O型、A型病毒引起的口蹄疫，免疫期為6個月，肌肉注射 2mL/頭。

5）口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗（OHM/02株+AKT～III株）。疫苗中含有滅活的口蹄疫O型毒株（OHM/02株）和A型Ⅲ系鼠化弱毒株（AKT-III株），滅活前的病毒含量均至少為107.5LD50/0.2mL。用于預防牛、羊O型、A型口蹄疫，免疫期為6個月，頸部肌肉注射，牛2.0mL/頭，羊1.0mL/只。

6）口蹄疫O型滅活疫苗（OJMS株）。本品系用口蹄疫病毒O型病毒接種BHK-21細胞培養(yǎng)，收獲懸浮細胞培養(yǎng)物，經二乙烯亞胺（BEI）滅活，加礦物油佐劑混合乳化制成。用于預防牛、羊O型口蹄疫，肌肉注射，牛2.0mL/頭，羊1.0mL/只。

7）口蹄疫O型滅活疫苗（OS株）。含滅活的口蹄疫O型病毒，滅活前每0.1mL病毒含量應至少為107.0TCID50，或每0.2mL病毒含量應至少為107.0LD50。用于預防牛、羊、鹿和駱駝O型口蹄疫，免疫期為4～6個月。肌肉注射，牛、鹿和駱駝2mL/頭（峰），羊1mL/只。

8）口蹄疫O型滅活疫苗（OHM/02株）。疫苗中含滅活的口蹄疫O型病毒OHM/02株，滅活前的病毒含量應至少為107.0LD50/0.2mL。用于預防牛、羊O型口蹄疫，免疫期為6個月。肌肉注射，牛2.0mL/頭，羊1.0mL/只。

2.免疫操作。免疫前要嚴格做好接種器具（注射器，針頭、鑷子以及有關容器等）的消毒準備工作。

1）最好使用一次性注射器，或者使用牲畜專用的可定量注射器，注意注射器定量卡是否松動，用前高壓滅菌或煮沸消毒法消毒至少15min。

2）使用12～16號針頭。針頭的消毒應采用高壓蒸汽法。

3）毛剪和鑷子使用前應高壓滅菌或煮沸消毒法消毒至少15min。

4）滅菌后的注射器與針頭應放置于無菌盒內備用。免疫接種工作由獸醫(yī)防疫人員或養(yǎng)殖場獸醫(yī)人員執(zhí)行。做好養(yǎng)殖場獸醫(yī)人員的技術培訓，嚴格按接種操作要求進行。接種前應備有足夠的碘酊棉球、注射器、針頭、抗過敏藥物以及免疫記錄本等。免疫注射時應適當保定動物，嚴禁使用“飛針”注射。接種前將疫苗緩慢充分搖勻，防止氣泡影響疫苗劑量的準確性。疫苗在使用過程中應保存在保溫箱內，注意防凍、防曬，疫苗必須在2～8℃之間保存，切不可凍結。吸出的疫苗不可回注于疫苗瓶內，每瓶疫苗啟用后，限當日用完，超過24h則廢棄。

嚴格按照產品說明書中限定的劑量免疫。注射部位要準確，動作要熟練，確保免疫劑量準確足量。吸取疫苗時應在疫苗瓶邊緣插入一支進氣針頭，吸苗針頭應從瓶塞中央進人并固定在瓶塞上專用于吸取疫苗，另安裝注射針頭用于疫苗接種。接種前應仔細定量，在注時針頭上覆蓋棉球，將針筒排氣溢出的疫苗液吸積于棉球上，并將其收集于專用瓶內集中處理。進氣針頭、吸取針頭和注射針頭三者之間應嚴格分開使用，注射器嚴禁在疫苗瓶內排空氣。注射部位用碘酊或70%酒精棉擦凈消毒。牛注射部位為頸部上1/3處深層肌肉。

3.免疫不良反應的預防及處理。

通常大多數牛在接種疫苗后不會出現明顯的不良反應，而少數牛常會出現一過性的精神沉郁、食欲下降，注射部位出現短時輕度炎性水腫等局部或全身性異常表現，這都是注苗后的正常反應。但有時會發(fā)生反應程度嚴重（如過敏反應，表現為缺氧、黏膜發(fā)紺，呼吸困難、口流白沫，全身肌肉顫抖、出汗，嘔吐食物、虛脫或驚厥等臨床癥狀）或出現反應的牛數量較多的情況，原因通常是由于疫苗的質量低劣、注射劑量過大、操作錯誤、接種途徑或使用對象不準等因素引起。即便如此，我們仍可以通過一些預防和應急措施最大程度地減少注射疫苗的不良反應和損失。

1）不良反應的預防。接種前后一周內飼料中可適當添加小劑量的左旋咪唑、亞硒酸鈉和維生素E等免疫增強劑類物質。不要使用腎上腺素類的激素藥物或免疫抑制性藥物（如鏈霉素、新霉素、卡那霉素、四環(huán)素等）或抗病毒藥物。

在免疫接種前必須進行牲畜健康狀況、體質等生理狀況的檢查，病畜、弱畜、孕畜可暫緩接種，其免疫嚴格按說明書要求進行及時補免。

免疫接種最好選擇在溫度適宜、天氣晴朗的時候進行，特別是豬的免疫應盡量避開陰雨天，夏季在早晚涼爽時進行，冬天在中午溫暖時進行。

免疫接種前應盡可能避免動物一些劇烈活動（如長途運輸、轉群、采血等），防止牲畜處于應激狀態(tài)，在接種過程中更應采取必要措施以避免過分驅趕或抓取牲畜。

免疫后須給牲畜適當時間休息，同時兌制多維電解質水供其自由飲用，并密切觀察是否出現異常反應，對表現持續(xù)高熱的牲畜除了供給充足的多維電解質水之外，還需采取退熱措施。

2）不良反應的處理

一般反應：個別牛注射疫苗后出現輕度精神萎靡或不安，食欲減少和體溫稍高等情況，一般不需要治療，將其置于適宜環(huán)境下1～2d，癥狀即可自行減輕或消失，不必采取治療措施。

急性不良反應：極個別牛注射苗后可能出現急性過敏反應，呼吸加快、眼結膜充血、發(fā)抖、皮膚發(fā)紫、口吐白沫、頻頻排便、后肢不穩(wěn)或倒地抽搐，如搶救不及時很可能死亡。一般需盡快肌注地塞米松磷酸鈉30mg，皮下注射0.1%鹽酸腎上原素5mL。若發(fā)生過敏反應病牛體溫超過40℃，可注射復方氨基比林。若發(fā)生過敏反應的病牛心臟衰竭、皮膚發(fā)紫，可注射安鈉咖，注意保溫，并給予充足、干凈的飲水。

最急性不良反應：迅速皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素5mL，20min后根據緩解程度，可重復同劑量再注射一次。對休克牛，除上述方法外，還要迅速針刺耳尖、尾根、蹄頭、大脈穴，放少量血，迅速將去甲腎上腺素10mg加入10%葡萄糖注射液1500mL，靜脈滴注，待其蘇醒、脈律恢復后，再將VC 5g、VB6 3g加入5%葡萄糖注射液2000mL靜脈滴注，然后再用5%的碳酸氫鈉注射液500mL靜脈滴注即可。

4.免疫程序。根據疫苗種類和群體免疫抗體水平制定適宜的免疫程序，并嚴格按免疫程序實行免疫接種工作，但根據突發(fā)事件和實際情況的變化可以調整免疫程序。生產母牛，每年普免2～3次。犢牛，出生后3～4個月首免，間隔3～4周二免。種公牛，每年普免3次。補充免疫：按程序免疫之后經免疫抗體檢測針對免疫抗體產生不佳的?？蛇M行補免。緊急免疫：當地發(fā)生疫情時，要對疫區(qū)、受威脅區(qū)域的全部易感動物進行一次強化免疫。

5.免疫標識與免疫檔案

1）養(yǎng)殖場應每季度提前向動物防疫主管部門申報養(yǎng)殖種類、養(yǎng)殖數以及所需的動物標識數量，年存欄1000頭以上場須自行配備動物標識識讀器。

2）對動物免疫接種后須按照《畜禽標識和養(yǎng)殖檔案管理辦法》中的規(guī)定，建立免疫檔案，加施牲畜標識。

3）免疫接種后應及時認真地填寫免疫接種記錄表，內容包括疫苗名稱、接種日期、舍號、欄號、年齡、免疫頭數、免疫劑量、疫苗信息（類別、生產廠家、有效期、批號等）以及接種人員，針對每一頭牲畜建立規(guī)范性的免疫檔案。

6.口蹄疫監(jiān)測。監(jiān)測措施是口蹄疫防控和流行病學調查的重要內容和手段之一，所有影響口蹄疫發(fā)生與擴散的風險因素都屬于監(jiān)測范圍。而規(guī)模養(yǎng)殖場口蹄疫發(fā)生風險的監(jiān)測內容主要是場區(qū)環(huán)境帶毒檢測，場區(qū)外環(huán)境的疫情調查、牲畜過往活動情況、牲畜帶毒情況以及畜群免疫狀況等。

1）監(jiān)測范圍。①牛群：養(yǎng)殖場內牛群發(fā)病、帶毒及抗體水平的檢測。②場區(qū)內環(huán)境：含飼料、飲用水等帶毒監(jiān)測。③場區(qū)外環(huán)境：關注養(yǎng)殖場周邊范圍內的疫情動態(tài)，包括疫情調查，場區(qū)附近過往易感動物（牛、羊、豬）活動情況等。

2）監(jiān)測頻率。①集中監(jiān)測：1年2次，分春秋季。春季集中監(jiān)測在5月底前完成，秋季集中監(jiān)測在11月底前完成。②日常監(jiān)測：各養(yǎng)殖場根據生產的實際情況隨時自行監(jiān)測，必要時，結合當地口蹄疫流行狀況增加監(jiān)測次數。一旦發(fā)現疑似病例，應緊急封鎖疫點、控制發(fā)病動物及同群牲畜，并立即報告當地動物防疫監(jiān)督部門。

3）監(jiān)測內容和方法。①臨床檢查：由飼養(yǎng)員負責每日例行的臨床檢查，即仔細觀察牛只是否表現口蹄疫臨床典型癥狀（如食欲減退、發(fā)熱、口及乳房部位出現水皰、跛行、喜臥等）。一旦發(fā)現異常情況，應立即報告養(yǎng)殖場獸醫(yī)和負責人員。②實驗室檢測：由養(yǎng)殖場獸醫(yī)診療室（若技術和裝備條件允許）負責實施，進行血清樣品的抗體檢測。

液相阻斷酶聯免疫吸附試驗（LB-ELISA）用于口蹄疫免疫抗體水平的檢測和評價，是OIE推薦的國際標準方法之一。根據口蹄疫的流行和免疫情況，有時需檢測多個血清型的免疫抗體。

正向間接血凝試驗（IHA）適用于口蹄疫免疫抗體水平的大規(guī)模監(jiān)查。雖非國際標準方法，但因其操作簡便，價廉。在基層獸醫(yī)實驗室仍有較大應用價值。

4）樣品采集。①采樣原則：根據檢測目的采集相應樣品，采集的檢測樣品要有代表性，樣品的采集、保存、運輸要按國家《口蹄疫防治技術規(guī)范》技術標準進行。②采樣數量：樣品采集總量應根據養(yǎng)殖場實際的養(yǎng)殖規(guī)模、牲畜用途、畜群大小確定。基本原則是必須符合統計學要求。③采樣時間：為監(jiān)測養(yǎng)殖場動物血清抗體水平，評估疫苗免疫效果，應分別在注苗前和注苗后30d采集血清樣品1次進行檢測。

5）檢測結果的判定。液相阻斷ELEA，免疫后30d抗體效價≥26為免疫合格。

6）免疫效果的評價。存欄豬群免疫抗體合格率≥70%，牛群免疫抗體合格率80%時，表明家畜群體的免疫水平達到了國家規(guī)定要求。未達抗體合格標準的，應及時進行補免。