葛根黃酮對癲癇大鼠海馬NF-κB mRNA和IL-10 mRNA表達(dá)的影響

何小群　黃建敏　劉國軍　李津　馮雪萍

【摘要】 目的：探討葛根黃酮對癲癇大鼠腦神經(jīng)的保護(hù)作用。方法：制備葛根黃酮溶液，通過腹腔注射亞驚厥劑量戊四氮構(gòu)建癲癇大鼠模型，將大鼠分為對照組、PZT模型組和葛根黃酮干預(yù)組，在7、14、21、28 d分別取大鼠海馬組織進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測NF-κB mRNA和IL-10 mRNA的表達(dá)。結(jié)果：隨著給藥時間的延長，與對照組比較，PZT模型組各時間點(diǎn)NF-κB mRNA和IL-10 mRNA的表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），葛根黃酮干預(yù)組在21、28 d NF-κB mRNA和IL-10 mRNA的表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;且與模型組比較，干預(yù)組在21、28 d NF-κB mRNA和IL-10 mRNA的表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：葛根黃酮溶液對癲癇大鼠腦損傷具有一定的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 葛根黃酮; 癲癇; 大鼠; 核轉(zhuǎn)錄因子-κB; 白細(xì)胞介素-10

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.10.004 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1674-6805（2019）10-000-03

Effects of Pueraria Flavones on Expressions of Neclear Factor-κB mRNA and IL-10 mRNA in Hippocampus of Epileptic Rats/HE Xiaoqun，HUANG Jianmin，LIU Guojun，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（10）：-10

【Abstract】 Objective：To investigate the protective effects of Pueraria Flavones on brain nerve in epileptic rats.Method：Pueraria Flavones solution was prepared，and the epileptic rat model was constructed by intraperitoneal injection of Pentylenetetrazol.The rats were divided into control group，PZT model group and Pueraria Flavone intervention group.The hippocampal tissues of rats were extracted on 7 d，14 d，21 d and 28 d respectively for real-time quantitative PCR detection of the expression of NF-κB mRNA and IL-10 mRNA.Result：With the extension of drug administration time，compared with the control group，the expression of NF-κB mRNA and IL-10 mRNA in the PZT model group increased at each time point，the differences were statistically significant（P<0.01）.And compared with the model group，the expression level of NF-κB mRNA and IL-10 mRNA in the Pueraria Flavones intervention group on 21 d and 28 d were decreased，the differences were statistically significant（P<0.01）.Conclusion：Pueraria Flavones Solution has a protective effect on brain injury of epileptic rats.

【Key words】 Pueraria flavones; Epilepsy; Rat; NF-κB; IL-10

First-authors address：Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China

葛根是豆科植物野葛的干燥根莖，其主要成分為異黃酮類化合物[1]，包含葛根素、大豆苷元、大豆苷等，具有廣泛的藥理學(xué)作用，如擴(kuò)血管、抗衰老、抗血栓、降血糖、神經(jīng)保護(hù)、增強(qiáng)免疫力等。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射亞驚厥劑量戊四氮建立慢性癲癇大鼠模型，以葛根黃酮設(shè)組進(jìn)行干預(yù)，檢測大鼠海馬組織中NF-κB、IL-10的表達(dá)在不同時期的變化，首次探討其對癲癇大鼠腦神經(jīng)的保護(hù)作用，從分子水平研究葛根黃酮對慢性致癇大鼠的干預(yù)機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器、HH-2K4電熱恒溫水浴鍋、RE-3000A（3L）型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、TG16-WS臺式高速離心機(jī)、722型分光光度計、FA（N）/JA（N）電子天平、ALPHA1-2/LD-plus冷凍干燥機(jī)、AB-8型大孔樹脂柱。

1.2 動物

SD雄性大鼠80只，體重200～220 g，由右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。生產(chǎn)許可證號SCXK（桂）2012-0003，動物飼養(yǎng)在SPF級實(shí)驗(yàn)室中，自由攝食飲水。

1.3 主要藥品與試劑

干燥葛根片購自廣西百色市生物制品藥店，生產(chǎn)日期：2015年12月15日。戊四氮（PTZ）購自美國Sigma公司;水合氯醛購自依托生物;引物和熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物公司。

1.4 葛根黃酮的制備、鑒定和測定

制備：干燥葛根片粉碎，過40目篩后，置干燥容器備用。精密稱取葛根粉末200 g，加2 000 ml 70%乙醇，密閉浸泡過夜，超聲波提取2.5 h，抽濾。濾渣再加1 500 ml 70%乙醇，超聲波提取1.5 h，抽濾，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后用乙酸乙酯 萃取3次，真空干燥，得到葛根粗制總黃酮粉末。然后將提取得到的粗黃酮化合物在AB-8大孔樹脂柱上進(jìn)行純化，用500 ml 60%的乙醇洗脫，收集乙醇部分，減壓濃縮，在冷凍機(jī)中干燥得到純化后的總黃酮。

鑒定和測定：將純化后得到的總黃酮取少量溶于1 ml 甲醇溶液試管中，加入濃鹽酸2～3滴，在加少量鎂粉，觀察到玫瑰紅色即可確定為紅薯葉總黃酮。采用以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品的比色法測定總黃酮含量，將制備所得的葛根黃酮稀釋為160 mg/ml備用。

1.5 癲癇模型的建立

SD大鼠80只，隨機(jī)選取20只作為空白對照組，其余用于制作大鼠癲癇模型。造模方法：每天上午按照35 mg/kg劑量給60只SD大鼠腹腔注射亞驚厥PZT，空白對照組予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射[2]。癲癇等級評分如下：0級表現(xiàn)為無抽搐發(fā)作;Ⅰ級表現(xiàn)為面部陣攣，包括眨眼、節(jié)奏性咀嚼、動須等;Ⅰ級伴有節(jié)奏性點(diǎn)頭記為Ⅱ級;Ⅱ級伴有前肢肌陣攣，但后肢能保持直立位可記為Ⅲ級;Ⅲ級伴有后肢直立位記為Ⅳ級;雙前肢陣攣明顯加重，無法平衡導(dǎo)致跌倒或抽搐死亡記為Ⅴ級。超過4周仍未點(diǎn)燃的大鼠則棄用。

1.6 給藥方法

造模大鼠隨機(jī)平均分為模型組和葛根黃酮干預(yù)組，干預(yù)組大鼠每天灌胃葛根黃酮（150 mg/100 g）后1 h接著注射PZT，空白對照組和模型組灌胃等劑量的0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)灌胃4周。各組大鼠分別于服藥后7、14、21、28 d時間點(diǎn)各隨機(jī)取5只，用10%水合氯醛溶液麻醉、斷頭取腦，保持低溫條件，快速分離海馬，用4 ℃ 0.9%氯化鈉注射液洗滌，保存溫度為-80 ℃[2]。

1.7 Real-time PCR檢測方法

參照Real-time PCR檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，以β-actin為內(nèi)參。NF-κB、β-actin和IL-10基因引物序列及擴(kuò)增長度見表1。擴(kuò)增條件參照說明書執(zhí)行，最后做溶解曲線分析。采用2-ΔΔct法進(jìn)行相對定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，計量資料以（x±s）表示，運(yùn)用單因素方差分析（LSD法），計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)描述

對照組，注射生理鹽水后，狀態(tài)良好，行為無明顯變化，食欲和飲水均正常，體重逐漸增加;PZT模型組，隨著注射次數(shù)的增加，癲癇發(fā)作的大鼠數(shù)量增多，發(fā)作的等級加重，在第7天后大部分模型組大鼠發(fā)作等級都能達(dá)到4級及以上，食欲和飲水量下降，精神沉郁，逐漸消瘦，被毛無光澤，對注射操作敏感性增高;葛根黃酮干預(yù)組大鼠癲癇發(fā)作4級以上要比模型組晚10～12 d，相同時間點(diǎn)癲癇的發(fā)作等級也比模型組低，隨著灌胃時間的延長，干預(yù)組大鼠的精神狀態(tài)及食欲優(yōu)于模型組，低于對照組。

2.2 NF-κB mRNA的表達(dá)檢測結(jié)果

與對照組比較，PZT模型組在各個時間點(diǎn)NF-κB mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），葛根黃酮干預(yù)組在7 d和14 d時NF-κB m RNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），在21 d和28 d時NF-κB mRNA表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與干預(yù)組比較，模型組NF-κB mRNA的表達(dá)量隨著給藥時間的延長逐漸增多，均明顯高于對照組和干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表2。

2.3 IL-10 mRNA的表達(dá)檢測結(jié)果

與對照組比較，模型組各個時間點(diǎn)IL-10 mRNA表達(dá)量均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），干預(yù)組在21 d和28 d時IL-10 mRNA表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），7 d和14 d時比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與干預(yù)組比較，模型組IL-10 mRNA表達(dá)隨著給藥時間的延長，表達(dá)量逐漸增多，均高于對照組和干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表3。

3 討論

癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜難治愈。目前認(rèn)為癲癇發(fā)作所引起的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致癲癇發(fā)作后腦組織病理改變，特別是海馬結(jié)構(gòu)損傷的主要原因之一。癲癇發(fā)作時產(chǎn)生的大量氧自由基活化轉(zhuǎn)錄NF-κB，NF-κB可協(xié)助轉(zhuǎn)錄其他許多炎癥因子從而對機(jī)體造成氧化損傷[3]。NF-κB（核轉(zhuǎn)錄因子）是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，與炎癥、免疫反應(yīng)以及突觸可塑性及細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等多種生理和病理過程密切相關(guān)。IL-10是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，它可以抑制NF-κB的活化，其機(jī)制可能是抑制大腦皮層神經(jīng)元興奮性氨基酸 NMDA 受體的表達(dá)，抑制鈣離子內(nèi)流等發(fā)揮作用[4]。臨床上癲癇患者血清IL-8、IL-10、TNF-α的含量明顯高于健康者，提示這些因子與癲癇的發(fā)病有關(guān)[5]。研究表明NF-κB信號通路在許多細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的基因表達(dá)和調(diào)控中起著重要作用。其過度表達(dá)會導(dǎo)致機(jī)體的炎癥反應(yīng)和組織病理損傷[6]，如果有效抑制其過度表達(dá)，對癲癇的控制和治療具有重要的意義。

葛根黃酮藥理作用廣泛，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。潘洪平等[7]研究表明葛根素可以減輕缺血性大鼠腦細(xì)胞的損傷，提高其熱休克蛋白70（HSP70）表達(dá)水平，從而起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。黎榮等[8]使用葛根素干預(yù)帕金森病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)葛根素對6-羥基多巴胺所致PD大鼠黑質(zhì)組織神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，機(jī)制可能與其抑制過氧化應(yīng)激作用以及調(diào)節(jié)內(nèi)源性INOS、CREB蛋白的表達(dá)有關(guān)。王雅莉等[9]觀察不同濃度葛根素對去卵巢大鼠認(rèn)知功能及海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元元電鏡下形態(tài)的影響，透射電鏡結(jié)果表明，葛根素在不同濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用越強(qiáng)，并有一定的劑量依賴關(guān)系，發(fā)現(xiàn)葛根素可以促進(jìn)去卵巢大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)，減輕因雌激素缺乏而引起的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡作用。金錫姣等[10]使用葛根黃酮干預(yù)腦缺血再灌注損傷大鼠，檢測大鼠腦組織中一氧化氮（NO）含量及一氧化氮合酶（NOS）活性的變化，結(jié)果表明葛根黃酮能降低腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中NO含量，并抑制NOS活性，對大鼠腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。梁云星等[11]使用葛根黃酮搽劑治療神經(jīng)根型頸椎病大鼠，結(jié)果表明葛根黃酮搽劑能有效減輕神經(jīng)根型頸椎病大鼠的神經(jīng)根性疼痛，改善受損神經(jīng)根狀態(tài)。馬麟等[12]通過放射免疫法測得桂枝加葛根湯治療組可降低PGE2、6-K-PGFla水平，抑制炎癥介質(zhì)生成。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PZT模型組隨著給藥時間的延長，NF-κB mRNA和IL-10 mRNA的表達(dá)量逐漸增高，高于對照組和干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;通過灌喂葛根黃酮，干預(yù)組在第21、28天NF-κB mRNA和IL-10 mRNA的表達(dá)量低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），這與已有研究結(jié)果IL-10具有抑制NF-κB活化的作用是相吻合的。因此，從本實(shí)驗(yàn)可以看出葛根黃酮對大鼠癲癇模型具有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能是通過上調(diào)IL-10的表達(dá)抑制氧自由基活化轉(zhuǎn)錄NF-κB，

進(jìn)而抑制大量細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的基因表達(dá)，抑制炎癥的發(fā)展，達(dá)到保護(hù)腦神經(jīng)的作用。但其最佳的給藥劑量和具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

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