牛奶蛋白改性纖維免疫層析快速鑒定方法*

深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，國家營養(yǎng)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，廣東 深圳 518102

牛奶蛋白改性纖維是一種有別于天然纖維和化學(xué)纖維的新型纖維。其以牛奶為原料，經(jīng)脫水脫脂和分離提純等工序，使酪蛋白形成線性結(jié)構(gòu)，再與聚丙烯腈(PAN)進行交聯(lián)形成紡絲原液，最后通過濕法紡絲工藝制備而得(圖1)[1]。牛奶蛋白改性纖維含有17種氨基酸，其因具有良好的親膚性而越來越多地應(yīng)用于內(nèi)衣、床上用品等與皮膚直接接觸的紡織品生產(chǎn)中[2-3]。

圖1 牛奶蛋白改性纖維成型工藝流程

然而，由于牛奶蛋白改性纖維的生產(chǎn)成本較高，市場上用大豆蛋白改性纖維等價格較低的產(chǎn)品進行魚目混珠的現(xiàn)象屢見不鮮。其根本原因在于，缺少有效的牛奶蛋白改性纖維鑒定方法。目前的鑒別方法主要依據(jù)FZ/T 01057.2—2007《紡織纖維鑒別試驗方法 第2部分：燃燒法》，通過燃燒法鑒別纖維種類。然而，由于牛奶蛋白改性纖維和大豆蛋白改性纖維的燃燒特征區(qū)別并不顯著，極易導(dǎo)致誤判。文獻[4]通過NaOH溶解法和紅外光譜對牛奶蛋白改性纖維和大豆蛋白改性纖維進行鑒定，但部分化學(xué)染料的存在會對結(jié)果造成明顯干擾。正是由于目前的蛋白改性纖維鑒定方法尚不完善，才使得魚目混珠者有了可乘之機，因此亟待建立準確可靠且易于推廣的牛奶蛋白改性纖維鑒定方法。

免疫層析方法基于抗原抗體的高度特異性反應(yīng)原理，具有快速、簡單、成本低等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于腫瘤標志物、生物毒素、過敏藥等物質(zhì)的快速檢測[5-8]。蛋白改性纖維由于通過共價鍵交聯(lián)了特定的蛋白質(zhì)，因此其氨基酸序列具有了標志性特征。然而，利用免疫層析方法鑒別蛋白纖維面臨兩大難題：一是紡織工業(yè)中的蛋白纖維已經(jīng)改性且多數(shù)經(jīng)染色修飾，因而和天然蛋白存在較大差異，故難以被現(xiàn)有的抗體所識別；二是免疫層析需要在中性水溶液中進行，而改性后的蛋白質(zhì)的水溶性較差。本研究以牛奶蛋白改性纖維為例，通過篩選改性酪蛋白標志物并制備其單克隆抗體，將免疫層析技術(shù)應(yīng)用于紡織用蛋白改性纖維的鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)、牛血清白蛋白(BSA)、血藍蛋白、二硫代蘇糖醇(DTT)、氯金酸、Proclin 300(由美國Sigma公司生產(chǎn))；硝酸纖維膜(NC膜)、玻璃纖維、樣品墊、結(jié)合墊、吸水紙及PVC底板(由美國Millipore公司生產(chǎn))。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XYZ3100型三維膠體金點膜儀(由美國Bio-Dot公司生產(chǎn))；Milli-Q型水處理系統(tǒng)(由美國Millipore公司生產(chǎn))；Triple TOF 6600型ESI(Electron Spray Ionization)/TOF(Time of Flight)質(zhì)譜(由AB SCIEX公司生產(chǎn))。

1.3 試驗樣品

牛奶蛋白改性纖維(氨基酸質(zhì)量分數(shù)為25.00%)、分別混紡莫代爾和羊毛的牛奶蛋白改性纖維(由上海正家牛奶絲科技有限公司生產(chǎn))；大豆蛋白/黏膠混紡纖維(由富麗達纖維有限公司生產(chǎn))；大豆蛋白/PVA(Polyvinyl Alcohol)混紡纖維(由嘉利蛋白纖維有限公司生產(chǎn))；其他用于評估特異性的紡織材料(由深圳市計量質(zhì)量檢測研究院樣品室提供)。

1.4 方法

1.4.1 改性蛋白肽段質(zhì)譜分析

在0.1 g牛奶蛋白改性纖維中加入10 mL的DTT質(zhì)量分數(shù)為0.10%的7M尿素水溶液，于60 ℃恒溫攪拌1 h。上清液用胰蛋白酶質(zhì)量分數(shù)為0.05%的水溶液稀釋1 000倍，并于37 ℃孵育2 h后用孔徑為0.2 μm的濾膜過濾，然后進行ESI/TOF質(zhì)譜分析。檢測結(jié)果于NCBI(National Center of Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中搜庫比對。

1.4.2 單克隆抗體制備

由北京華大蛋白有限公司合成肽段，氨基酸序列為YLGYLEQLLR-Cys。單克隆抗體制備參照文獻[9]。采用辛酸硫酸銨純化單克隆抗體[10]。

1.4.3 膠體金儲備溶液制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金儲備溶液[11]，方法如下：將1.0 g檸檬酸三鈉快速加入100 mL加熱煮沸的氯金酸質(zhì)量分數(shù)為0.01%的溶液中并不斷攪拌，當溶液變?yōu)樽霞t色時計時，繼續(xù)加熱回流10 min，當溶液冷卻后于4 ℃保存。

1.4.4 單克隆抗體-膠體金偶聯(lián)物的制備

取1 mL膠體金儲備溶液，使用濃度為0.2 mol/L的碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)膠體金儲備溶液的pH值至6.0，將單克隆抗體溶液逐滴加入磁力攪拌的膠體金儲備溶液中，攪拌30 min(分別以0.1、 0.2、 0.5、 1.0和2.0 μg/mL為單克隆抗體的標記質(zhì)量濃度)，然后緩慢加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為10.00%的BSA溶液，攪拌反應(yīng)30 min，封閉膠體金表面位點，繼續(xù)加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為1.00%的PEG 20000溶液，攪拌30 min后，以6 000 g離心力離心30 min，棄去上清液后加入0.12 mL金標抗體復(fù)溶液(配方為含質(zhì)量分數(shù)為0.05%的PEG 20000、 1.00%的BSA、 2.00%的海藻糖、0.05%的吐溫-20以及0.10%的Proclin 300的水溶液)反復(fù)吹打沉淀，重懸金標抗體。

1.4.5 紙條的組裝

使用三維膠體金點膜儀，分別以質(zhì)量濃度為0.3、 0.6和0.9 mg/mL的牛酪蛋白以及質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的IgG在NC膜上劃線，作為T線和C線。樣品墊用處理液(配方為含質(zhì)量分數(shù)為1.00%的BSA、 0.50%的吐溫-20、 0.05%的Proclin 300的PBS緩沖液，且pH值為7.2的水溶液)浸泡過夜。結(jié)合墊用質(zhì)量分數(shù)為0.10%的吐溫-20浸泡過夜，60 ℃下干燥2 h，再將單克隆抗體-膠體金偶聯(lián)物噴涂于結(jié)合墊。NC膜、樣品墊、結(jié)合墊均于37 ℃真空干燥2 h后，之后和吸水紙一起按照圖2所示的結(jié)構(gòu)粘貼于PVC底板上。使用切條機將其裁剪成4 mm寬的窄條后裝上卡殼，并加入干燥劑，封裝于錫箔袋中密封備用。

1.4.6 檢測步驟

牛奶蛋白改性纖維檢測流程見圖2。稱取1.0 g纖維樣品加入10 mL的7M尿素水溶液中，沸水處理10 min，上清液用去離子水稀釋20倍后量取0.15 mL加至檢測卡的樣品孔，5 min后按圖2所示步驟判斷結(jié)果。

圖2 牛奶蛋白改性纖維鑒定流程

1.4.7 牛奶蛋白改性纖維的染色

選用直接耐酸大紅4BS(C.I. Direct Red 23)、弱酸艷紅B(C.I. Acid Red)、陽離子紅X-GRL(C.I. Basic Red 249)以及活性紅X-3B(C.I. Reactive Red 194)染料，參照文獻[12]對牛奶蛋白改性纖維進行染色。

1.4.8 免疫層析法評估

以氨基酸質(zhì)量分數(shù)為25.00%的牛奶蛋白改性纖維為實物標樣，摻入不同量的PAN制備氨基酸質(zhì)量分數(shù)分別為0.30%、 1.00%、 3.00%、 10.00%和25.00%的樣品。使用免疫層析方法進行檢測，以評估方法的檢出限。

為驗證該檢測方法的可行性，采用其對2種混紡牛奶蛋白改性纖維、3種其他蛋白改性纖維、3種天然蛋白纖維、4種纖維素纖維和6種合成纖維進行鑒定。同時，為評估化學(xué)染料是否會對該檢測方法的結(jié)果造成干擾，從蛋白改性纖維常用的直接染料、弱酸性染料、陽離子染料和活性染料中各選取了一種代表性染料進行染色，之后采用免疫層析法進行檢測。

穩(wěn)定性是膠體金免疫層析試紙條能否推廣應(yīng)用的關(guān)鍵參數(shù)。對于定性試紙條來說，批內(nèi)和批間結(jié)果應(yīng)當一致。本研究使用相同批次和不同批次的試紙條分別對同一種牛奶蛋白改性纖維(陽性對照)和PAN纖維(陰性對照)的穩(wěn)定性進行測定。

1.4.9 免疫層析法應(yīng)用

本研究從網(wǎng)絡(luò)上購買了8個標簽中標注有牛奶蛋白改性纖維的紡織品，并采用本研究建立的方法進行檢測，以對市售標示有牛奶蛋白改性纖維的產(chǎn)品進行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛奶蛋白改性纖維的特征肽段

尋找牛奶蛋白改性纖維的特征肽段是建立免疫檢測的重要基礎(chǔ)。雖然目前關(guān)于乳蛋白的研究已較為透徹，特征肽段已可從NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢到，但是對于改性蛋白纖維，由于其交聯(lián)反應(yīng)較為復(fù)雜且多個活性位點發(fā)生了共價結(jié)合，必須重新進行分析。本研究通過胰酶水解法，從牛奶蛋白改性纖維中得到了20個特征肽段(表1)，分別來源于αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白，但并未發(fā)現(xiàn)乳清蛋白，說明牛奶蛋白改性纖維主要由上述4種酪蛋白構(gòu)成。

表1 牛奶蛋白改性纖維經(jīng)胰酶水解法處理得到的特征肽段序列

2.2 肽段的選擇

雖然2.1節(jié)得到了牛奶蛋白改性纖維的特征肽段，但是合成肽段在空間結(jié)構(gòu)和免疫原性上都和實際的蛋白存在差異，鑒于對20個肽段逐一進行測試的工作量較大，本研究通過以下原則進行篩選：

(1) 選擇宏量蛋白上的肽段，如此可獲得較高的方法靈敏度。αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白分別占牛酪蛋白的質(zhì)量比為40.00%～50.00%、 5.00%～10.00%、 25.00%～35.00%和8.00%～15.00%。因此優(yōu)先選擇來源于αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的肽段。

(2) 選擇含有酪氨酸的肽段。由于酪氨酸的苯基具有較強的免疫原性且在酪蛋白中含量較大，因此更容易誘導(dǎo)試驗動物產(chǎn)生特異性抗體[13]。

(3) 盡量避免含有賴氨酸、組氨酸和半胱氨酸的肽段。牛奶蛋白改性纖維在成衣制作中需通過活性染料染色，而這類染料往往會和蛋白上的活性氨基、羥基和巰基結(jié)合，因此含有這類基團的氨基酸，如賴氨酸、組氨酸和半胱氨酸，應(yīng)盡量避免作為分析靶標。

基于上述策略，本文選用來自于αs1-酪蛋白的序列3作為目標半抗原，該肽段含有兩個酪氨酸，不包含易與活性染料結(jié)合的基團，具有良好的免疫原性和染色惰性。

2.3 牛奶蛋白改性纖維鑒定方法的建立

金標抗體的制備是膠體金標記免疫檢測方法的關(guān)鍵步驟。由于抗體過多會使檢測靈敏度變差，而膠體金過多會使抗體失活，因此抗體和膠體金的比例必須經(jīng)過優(yōu)化。本研究在氯金酸質(zhì)量分數(shù)為0.01%的膠體溶液中加入不同量的抗體。圖3所示為標記抗體的質(zhì)量濃度對抗體活性的影響，表明當抗體質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL時，條帶最清晰且不彌散、背景最干凈。

圖3 標記抗體質(zhì)量濃度對其活性的影響

在此條件下，本研究還對T線抗原濃度和結(jié)合墊的抗體噴涂量(金標抗體量)這兩個競爭金標免疫層析的關(guān)鍵參數(shù)進行了考察。和競爭ELISA(Enzyme-Linked Immune-Sorbent Assay)一樣，T線抗原作為競爭物，其濃度也會影響免疫層析效果。金標抗體量和T線抗原濃度過低均會導(dǎo)致獲得的T線的清晰度不足，使得結(jié)果難以判定，試紙條不穩(wěn)定且容易失效，因而無法進行商品化應(yīng)用。金標抗體量和T線抗原質(zhì)量濃度過高，雖能獲得清晰的T線條帶，但因抗原或抗體過量，需要更高濃度的待測藥物參與競爭反應(yīng)，這將影響檢測方法的靈敏度。表2所示為不同抗原抗體量下的試紙條顯色情況和靈敏度。其表明，在T線抗原質(zhì)量濃度為0.6 μg/mL、金標抗體量為6 μL/cm時，檢測靈敏度最高且條帶最為清晰。

表2 不同抗原抗體量下的試紙條顯色情況和靈敏度

2.4 檢測方法評估

樣品的前處理對于鑒定方法至關(guān)重要。牛奶蛋白改性纖維是一種經(jīng)過高度化學(xué)交聯(lián)的蛋白質(zhì)，常用的免疫學(xué)提取劑如PBST、 Tris-HCL等，無法對其進行提取。堿性溶液雖然能將其溶解，但是強堿條件下不能直接進行免疫分析，待pH調(diào)節(jié)至中性后蛋白又會析出。筆者課題組[14-15]研究發(fā)現(xiàn)，高溫的7M尿素對變性蛋白具有良好的提取效果，稍加稀釋即可用于免疫分析。如圖4所示，本研究所建立的牛奶蛋白改性纖維鑒定方法，在檢測含有氨基酸質(zhì)量分數(shù)為0.30%的牛奶蛋白改性纖維時，T線出現(xiàn)條帶，結(jié)果判定為陰性，因此該方法的檢出限為1.00%，相當于能檢測出混紡質(zhì)量分數(shù)為4.00%牛奶蛋白改性纖維的紗線。由于混紡紗線中牛奶蛋白改性纖維含量在4.00%以下時，其已失去了牛奶蛋白改性纖維的特性，因此本研究所建立的方法能夠滿足鑒定要求。

圖4 牛奶蛋白改性纖維的檢出限

免疫層析法對不同纖維的檢測結(jié)果見表3。其表明，該檢測方法能夠準確地從眾多纖維中鑒定出牛奶蛋白改性纖維，并且染色不會對鑒定結(jié)果造成影響。

表3 免疫層析法對不同纖維的檢測結(jié)果

免疫層析法的穩(wěn)定性測定結(jié)果顯示，未出現(xiàn)假陽性或假陰性，故可認為其檢測準確率為100%。

2.5 市售產(chǎn)品調(diào)查

市售標示有牛奶蛋白改性纖維產(chǎn)品的鑒定結(jié)果見表4。由表4可知，內(nèi)衣3和拖把的鑒定結(jié)果與實際不一致，說明關(guān)于牛奶蛋白改性纖維的標簽標注亟待規(guī)范。

表4 市售標示有牛奶蛋白改性纖維的產(chǎn)品鑒定結(jié)果

3 結(jié)語

本研究通過質(zhì)譜分析從現(xiàn)有的蛋白數(shù)據(jù)庫中比對出牛奶蛋白改性纖維中的特征肽段，并結(jié)合紡織品印染的實際情況，確定特征肽段半抗原?；诖税肟乖?，制備了抗牛奶蛋白改性纖維特征肽段的單克隆抗體，建立了牛奶蛋白改性纖維膠體金免疫層析鑒定方法。該方法具有簡單(只需對樣品加熱和稀釋)、快速(整個檢測過程約15 min)、準確(未發(fā)現(xiàn)假陰性和假陽性)、成本低(無需昂貴的分析儀器)的優(yōu)勢，有形成商品化檢測產(chǎn)品并廣泛推廣的潛力。更重要的是，該研究方法具有廣泛適用性，可為其他蛋白類纖維的鑒定提供新的思路。