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    電凝法制作Balb/c小鼠局灶性腦缺血模型的實驗研究

    2019-07-11 03:08:04張雪梅陳立杰焦卓敏
    實驗動物科學 2019年3期
    關鍵詞:局灶腦缺血腦組織

    張雪梅 李 兵 陳立杰 焦卓敏 黃 山 尚 宏

    (1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經內科, 哈爾濱 150086)(2. 哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院神經內科, 哈爾濱 150080)

    全球每年約有9%的死亡病例由腦卒中引起,而缺血性腦卒中的比例在其中約占80%,其發(fā)病率僅次于缺血性心臟疾病。因此對缺血性腦卒中進行有效防治具有重要的醫(yī)學意義和社會貢獻。現(xiàn)經臨床證實唯一能縮小梗死體積、減輕神經損傷的治療藥物是重組組織型纖溶酶原激活物(recombinant tissue plaminogen activator, rt-PA),且其有效治療時間窗只有4.5 h,因而臨床應用受到一定限制。其他藥物如抗凝、應用神經保護劑等,都不能對受損腦組織產生修復作用。因此,卒中的治療及預防成為當前神經科學研究的方向和熱點之一, 特別是其發(fā)病機制、臨床轉歸、新治療手段等成為目前卒中的基礎與臨床研究的熱點科學問題。在基礎研究中如何簡便,快速地建立卒中的動物模型成為一個較為棘手的問題。Balb/c小鼠是白變種實驗室老鼠,與眾多常用亞系一樣,起源于小家鼠Musmusculus。Balb/c小鼠的遺傳背景為近交系,因而它們之間的個體差異較小,遺傳基因更純,整體素質更好。如果能夠在Balb/c小鼠中成功地復制出卒中模型將為卒中的研究提供較好的動物模型。為此,本課題組擬采用電凝方法,通過阻斷大腦中動脈(middle cerebral artery occlusion, MCAO)的血流來成功復制Balb/c小鼠的局灶性腦缺血模型。為下一步進行腦缺血發(fā)病過程中腦保護、神經修復及發(fā)病機制等后續(xù)研究提供新的實驗動物模型。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    健康成年雄性Balb/c小鼠40只,體質量22~ 25 g/只(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院實驗動物中心提供),動物質量合格證號:SCXK-(黑)2013-001,實驗中對動物處置均符合中華人民共和國科學技術部2016年發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[1]。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

    主要試劑與儀器:2% 氯化三苯四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride, TTC),顯微鏡(BX41, Olympus, Japan)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1小鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)模型的制作: 步驟同以往實驗方法[2],小鼠適應性喂養(yǎng)1周,術前12 h禁食不禁水,稱重后用10% 的水合氯醛按450 mg/kg腹腔麻醉小鼠,保持小鼠麻醉1.5 ~2.0 h,將小鼠側臥固定于無菌手術臺上,術中應用保溫毯保持小鼠直腸溫度在36.5~ 37.5 ℃。于小鼠左側眼裂至左耳外耳道之間切口,剝離顳肌,于梨狀骨與下頜骨交匯點向頭側1 mm,背側3.5 mm處用電鉆鉆一個直徑為1.0~ 2.0 mm的小孔。剝離硬腦膜暴露大腦中動脈,用電凝刀電凝阻斷大腦中動脈近端以確保持久的破壞,然后用牙科粘合劑封閉小孔,縫合切口。術后將小鼠置于27~ 28 ℃恒溫箱中飼養(yǎng)。

    1.2.2模型制作成功評價方法 采用Longa的5級4分法標準[3]:0分:無神經功能缺損癥狀;1分:輕度局灶性神經功能缺損,即提尾不能伸展右側前爪;2分:中度局灶性神經功能缺損,即行走向右側轉圈;3分:重度局灶性神經功能缺損,即行走困難,并向右側傾倒;4分:不能自發(fā)行走,意識水平下降。手術后神經功能評分為1~3分的小鼠入選本次研究。術后第2天隨機取2只小鼠,1只取出腦組織放入切腦模具中,間隔2.0 mm連續(xù)冠狀切片,再將腦片放入含2%氯化三苯四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride, TTC)的磷酸鹽緩沖液中(PBS, pH=7.4),37 ℃恒溫避光孵育30 min后可見正常組織呈粉紅色,梗死灶呈白色。另1只小鼠取缺血區(qū)域腦組織進行切片,經HE染色確定缺血情況。

    1.2.3神經功能損傷評分: 小鼠的神經功能損傷情況采用神經系統(tǒng)疾病嚴重程度評分(mNSS)進行評估[4]。實驗前按評分方法對小鼠進行一定的訓練,選取評分為0分的正常小鼠,造模后24 h、72 h采用雙盲法分別進行mNSS評分評估各組動物神經功能損傷狀況。mNSS包括運動試驗和平衡木試驗,根據所能完成任務的分值統(tǒng)計得分。mNSS總分為12分,評分越高表明神經功能損傷越嚴重。

    1.2.4實驗腦組織的提?。?0%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,迅速開胸暴露心臟,行主動脈插管,剪開右心耳為灌注液流出口,在10~ 20 min內經左心室用37 ℃生理鹽水200 mL快速沖洗,然后用4%多聚甲醛/0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(4 ℃, pH=7.4) 300 mL灌注固定,40 min內灌注完,迅速斷頭取腦,放入4%的多聚甲醛固定液,在4 ℃環(huán)境中放置24 h。然后將腦組織進行沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋,以前囟為起始,切成等厚(15 μm)冠狀切面腦片,每10張取1張進行HE染色。染色后顯微鏡下觀察組織形態(tài)學變化。

    1.3 統(tǒng)計方法

    2 結果

    2.1 MCAO模型評估

    MCAO術后小鼠出現(xiàn)右側前肢屈曲內收,前進不能,向右繞圈,站立不穩(wěn),平衡能力明顯減弱,表明造模成功。

    2.2 小鼠腦缺血區(qū)組織病理學檢測

    術后24 h小鼠腦組織切片TTC染色, 假手術組織染成粉紅色,未見梗死灶(見圖1,H-L),模型組左側大腦皮質梗死灶呈白色(見圖1,C-G),顯示手術半球明顯缺血。取小鼠損傷區(qū)域腦組織切片行 HE染色以確定損傷情況(見圖1,M-O),結果顯示梗死病灶及周圍組織結構變得疏松,間質水腫伴隨空腔形成,且著色較淺,神經細胞數(shù)量明顯減少,胞體皺縮,部分細胞輪廓欠清,有程度不等的神經細胞變性壞死,核固縮, 核仁消失現(xiàn)象。證實腦缺血模型制作成功。

    2.3 行為學觀察結果

    如表1所示,局灶性腦缺血后存活動物均有不同程度的神經功能缺損。隨著存活時間的延長,神經功能在短時間內并沒有得到恢復。模型組在術后第24 h神經功能缺損評分明顯高于假手術組,且這種差別可維持到術后第72 h (P<0.05)。

    表1 電凝法對小鼠MCAO后神經學評分Table 1 Evaluate the Neurological Scores of MCAOMice using the Electrocoagulation Method

    圖1 小鼠腦缺血區(qū)組織病理學檢測注:A-B,活體觀察;C-L,TTC染色;M-O,HE×10Fig.1 Histopathological examination of cerebral ischemic tissue in ratsNote:A-B, somatoscopy; C-L, TTC staining; M-O, HE×10

    3 討論

    在發(fā)達國家,隨著人口的逐步老齡化,卒中成為發(fā)病率和死亡率都較高的疾病之一。缺血性卒中是由于腦血管(主要為大腦中動脈)或其分支的血栓性或栓子性阻塞所致,約占所有類型卒中的 80%[5]。藥物或是機械再灌注治療是缺血性發(fā)作急性期最有效的治療方法,其中50%~ 70% 患者都有很好的愈后。然而因為治療時間窗短等各種嚴格的限制,這些治療方法僅適用于不到 10% 的患者中[6]。卒中的治療及預防成為當前神經科學研究的方向和熱點之一,特別是其發(fā)病機制、臨床轉歸、新治療手段等成為目前卒中的基礎與臨床研究的熱點科學問題。而建立一種可靠的模擬人類缺血性腦血管病的實驗動物模型對腦缺血的發(fā)病機制研究至關重要。

    在各項研究中,鼠實驗性急性腦缺血模型使用最為廣泛[7],其中大腦中動脈阻塞(MCAO)模型是目前最常用的模擬人類缺血缺氧性腦病的實驗動物模型。目前較為常用的方法有Tamura等在1981[8]年提出的電凝法和Longa等[9]于1989年提出的線栓法,其他方法還有光化學法[10],微栓子栓塞法[11]等。目前線栓法是應用最多的造模方法[12],但是其缺點是模型之間梗死面積差異較大,均一性較低,梗死面積大,死亡率高[9]。電凝法也是應用較多的一種造模方法,它具有均一性高,術后死亡率低,模型存活時間較長等優(yōu)點[8]。

    目前MCAO模型的制備多采用大鼠,但是隨著腦缺血研究逐步向基因領域的延伸,并鑒于大多數(shù)轉基因實驗動物來源于小鼠,因此迫切需要建立一種小鼠的局灶性腦缺血模型,以便于在基因水平進行腦缺血損傷的病理生理改變的機制,預后及藥物治療作用的研究。但由于小鼠頸總動脈較細,線栓插入困難,模型制作成功率低,小鼠死亡率高。我們采用開顱機械閉塞大腦中動脈法在直視下操作準確可靠,與人類缺血性卒中的病理改變較為接近,即MCA阻斷而側支循環(huán)尚存,受累腦組織包括嚴重缺血的中心區(qū)(梗塞灶)、缺血受損傷的周圍區(qū)(半暗帶)及接近正常的外圍帶, 梗死模型成功率較高,梗死范圍穩(wěn)定,梗死效果較好,動物存活時間長。

    因此本研究采用小鼠,小鼠體質量差異小,并且電凝法建立小鼠 MCAO 缺血模型操作簡便,手術時間短,提高了模型制作的成功率,減少了術后動物死亡率,提高了模型制作的穩(wěn)定性,縮短了模型制作的操作時間。為系統(tǒng)地研究腦缺血的病理生理及觀察藥物的治療作用提供了一個較接近臨床的、重現(xiàn)性好、可控的腦缺血模型。

    腦組織厚片TTC染色是研究腦缺血梗死灶常用的染色方法。TTC與完整的線粒體氧化酶系反應,誘發(fā)產生深紅色產物而使正常組織染色;缺血組織的線粒體損傷[13],不能誘導染色反應而呈白色,容易鑒別,因此我們采用此方法來觀察腦組織梗死灶。術后 24 h 小鼠腦組織切片 TTC 染色,可見大腦皮質梗死灶呈白色,手術半球明顯缺血。由于卒中引起的腦損傷通常與運動、感覺和認知功能受損等相關,很多實驗室的研究集中于評估與動物模型的腦缺血相關的認知和行為學改變。到目前為止,沒有單一的一種評價標準被普遍承認,大多數(shù)研究室都采用多種不同的評價標準來評價缺血效果。多種神經行為學評分系統(tǒng)被用于評價神經功能障礙的嚴重程度[14-15]。在本研究中, 我們采用的神經行為學觀察性評分指標包括運動試驗和平衡木試驗,對小鼠總體神經行為學評分的分析顯示,缺血損傷可明顯增加缺血后小鼠的神經行為學評分。此結果與 TTC 染色和鏡下病理組織變化結果相一致。

    以上結果提示,我們采用的電凝法可以在Balb/c小鼠中成功制作小鼠局灶性腦缺血模型。

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