光學(xué)生物傳感器在致病菌檢測(cè)中的研究進(jìn)展

許思齊，金敏

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安271018；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東泰安271018）

食物中的微生物病原體導(dǎo)致的食源性疾病，對(duì)人類的健康造成了嚴(yán)重的威脅。隨著疫苗和抗生素的發(fā)展與應(yīng)用，早期的疾病雖可以得到治愈，但新型的與耐藥性的病原體仍不斷涌現(xiàn)[1]。此外，目前致病菌的診斷方法效率低，速度慢，特別是在資源有限的地區(qū)，仍然難以找到合適的解決辦法。因此，需要發(fā)展更快速，準(zhǔn)確，多元化的診斷方法，且不需要復(fù)雜的檢測(cè)步驟和昂貴的分析儀器。以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)分析方法，即“金標(biāo)準(zhǔn)方法”，本質(zhì)上耗時(shí)耗力，且因致病菌侵襲范圍的擴(kuò)大而愈加復(fù)雜。這也導(dǎo)致以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的致病菌檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度顯著降低[2]。因此，研發(fā)具有多路復(fù)用、靈敏度高、特異性好和成本低等特點(diǎn)的致病菌診斷系統(tǒng)是今后研究的重點(diǎn)。

基于納米技術(shù)的生物傳感器與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比具有許多優(yōu)勢(shì)，包括高通量篩選、無標(biāo)記檢測(cè)、實(shí)時(shí)分析、低檢測(cè)限（limit of detection，LOD）和低樣本量等特征。隨著納米生物技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，各種類型的結(jié)合受體與配體，理化方法和納米技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物傳感器的開發(fā)，為提高致病菌檢測(cè)性能提供了新思路。目前已經(jīng)開發(fā)出了基于電子[3]，電化學(xué)[4]，機(jī)械[5]，核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）[6]和光學(xué)傳感[7]等技術(shù)的各種致病菌檢測(cè)生物傳感器。其中，可視化光學(xué)生物傳感器，特別是比色傳感器，更加易于使用，且檢測(cè)效率高，便攜，成本低。此外，光學(xué)生物傳感器中的等離子體生物傳感器具有優(yōu)異的靈敏度和復(fù)用能力。這些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)使光學(xué)傳感器商品化步伐不斷加快。

近年來，在致病菌檢測(cè)領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展趨勢(shì)是開發(fā)用于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)的可視化生物傳感器。隨著微流控和光學(xué)一體化技術(shù)的不斷發(fā)展，開發(fā)現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)變得更加可行。此外，前人已對(duì)基于智能手機(jī)系統(tǒng)研發(fā)的既有光源又有光檢測(cè)器的生物傳感器研究開發(fā)多年，既可以提供簡(jiǎn)單使用界面又可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。它不僅為發(fā)展中國家提供更加簡(jiǎn)便、廉價(jià)和高效的診斷系統(tǒng)，還能應(yīng)用于醫(yī)療保健、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面[8]。因此，相信可視化光學(xué)傳感器在未來的致病菌診斷和現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)護(hù)理點(diǎn)（point-of-care，POC）監(jiān)測(cè)中必定會(huì)占據(jù)更加重要的地位。

1 比色光學(xué)生物傳感器

比色生物傳感器是一種極具吸引力的光學(xué)生物傳感器系統(tǒng)，因?yàn)槿藗兛梢暂p松地通過反應(yīng)液顏色的變化，無需任何分析儀器，即時(shí)地用肉眼觀察到樣品中致病微生物。比色生物傳感器通常分為基于平板和溶液的兩種表現(xiàn)形式?；诩垙埡筒ＡУ钠桨逍问降膫鞲衅饔捎谄洳僮骱?jiǎn)單和分析樣品量小而更加受到青睞。作為具有代表性的產(chǎn)品，以側(cè)流層析檢測(cè)（lateral flow assay，LFA）為基礎(chǔ)的生物傳感器目前在市場(chǎng)上非常普遍。例如，杜邦公司生產(chǎn)的基于LFA 的生物傳感器，金標(biāo)檢測(cè)卡可以在10 min 內(nèi)通過特異性抗體檢測(cè)大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌和李斯特菌。生物梅里埃公司設(shè)計(jì)的產(chǎn)品可在15 min 內(nèi)檢測(cè)出鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌。這些產(chǎn)品都是利用了樣品在濾紙或膜中因毛細(xì)作用流動(dòng)擴(kuò)散以及通過金納米顆粒（gold nanoparticles，Au NPs）聚集而產(chǎn)生顏色的變化。

然而，基于LFA 的生物傳感器主要存在的缺點(diǎn)是靈敏度較低[9]。目前較為常用的方法是通過放大信號(hào)來提高靈敏度，例如，Hossain 等[10]使用磁珠預(yù)濃縮菌體細(xì)胞。此方法是將受體附著在磁珠上，從磁鐵樣品中分離出目標(biāo)致病菌細(xì)胞，使分離的細(xì)胞通過重新懸浮在任何所需檢測(cè)的體積中而實(shí)現(xiàn)易于濃縮的目的。該方法可使細(xì)胞濃縮10 倍～100 倍，從而能夠在30 min內(nèi)診斷出檢測(cè)限為5 CFU/mL 的大腸桿菌O157：H7，如圖1 所示。

圖1 基于LFA 的比色傳感器[10]Fig.1 The colorimetric biosensor based on the LFA[10]

Hadi 等[11]提出一種基于磁珠聚合且與手機(jī)攝像頭相連的生物傳感器。利用該傳感器系統(tǒng)，不僅能夠用肉眼檢測(cè)出樣品中的大腸桿菌，還能在計(jì)算機(jī)上使用手機(jī)攝像機(jī)和數(shù)字成像分析軟件進(jìn)行半定量分析，LOD 值可低至8 CFU/mL?；贚FA 的傳感器的另一個(gè)局限性是多重檢測(cè)的能力受限[12]。若想在一個(gè)單一的平板基片上進(jìn)行多重分析檢測(cè)，需要研究人員積極研發(fā)新型的制造工藝來固定特異的受體。此外，還有多種制作方法，包括光刻、噴墨印刷、等離子蝕刻和蠟印刷等[13-15]。這些制作工藝通過在親水性多孔紙基中創(chuàng)建物理或疏水的通道屏障，制作出多種的2D 或3D分析檢測(cè)裝置[16]?；谡奂埖闹谱鞣椒尚纬啥鄠€(gè)微斑點(diǎn)和圖層，其具有不同的模式，因每層的吸液率不同，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)分析物進(jìn)行多重分析與半定量測(cè)定[17]。

另一種形式是基于溶液體系比色生物傳感器。Tram 等[18]提出了一種簡(jiǎn)單而成本低廉的細(xì)菌檢測(cè)方法，見圖2。該方法利用細(xì)菌特異性RNA 切割DNA 酶探針作為分子識(shí)別元件，利用脲酶水解尿素來提高檢測(cè)液的pH 值，通過將脲酶與磁珠上的DNA 酶偶聯(lián)，將細(xì)菌的檢測(cè)轉(zhuǎn)化為pH 值的增加，更易于隨后的石蕊染料或pH 值試紙的比色檢測(cè)，雖然該方法操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，但靈敏度較低（5×102CFU/mL，1 h 和 5×103CFU/mL，2 h），因此如何提高靈敏度是比色生物傳感器檢測(cè)致病菌的關(guān)鍵點(diǎn)。

圖2 基于溶液體系的比色傳感器[18]Fig.2 The colorimetric biosensor based onsolution system[18]

2 等離子體光學(xué)生物傳感器

近年來在致病菌檢測(cè)的發(fā)展及應(yīng)用中，等離子體生物傳感器由于靈敏度和特異性高以及儀器和操作的簡(jiǎn)易性發(fā)展勢(shì)頭迅猛。其中最主要的兩類等離子體生物傳感器是表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）和表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced raman scattering，SERS）[18-19]。

SPR 傳感器因其穿透金屬表面的深度有限，及細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)與水介質(zhì)折射率相似，限制了其檢測(cè)較大體積的物體（如整個(gè)微生物細(xì)胞），通常靈敏度較低（LOD約為1.0×103CFU/mL）。經(jīng)過前人的不斷探索，目前SPR 生物傳感器的靈敏度已經(jīng)明顯提高。Torun 等[20]提出一種結(jié)合磁性納米顆粒的SPR 傳感器進(jìn)行磁分離的檢測(cè)大腸桿菌的方法，最檢測(cè)限可低至3 CFU/mL。Yoo 等[21]應(yīng)用局部表面等離子體共振（localized surface plasmon resonance，LSPR）對(duì)金納米顆粒（gold nanoparticles，Au NPs）結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾從而實(shí)現(xiàn)單一傳感器同時(shí)識(shí)別3 種不同的致病菌的突破，檢測(cè)限（limit of detection，LOD）為 30 CFU/mL。Kim 等[22]開發(fā)了一種用 Cu代替Au 作為外殼材料，并由核心結(jié)構(gòu)表面有序排列二氧化硅納米顆粒制作而成的LSPR 傳感器，且超靈敏地檢測(cè)到LOD 為10 fM 的致病菌的DNA，其原理圖如圖3 所示。

圖3 基于SPR 的傳感器[22]Fig.2 The plasmonic biosensor based on the SPR[22]

表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced raman scattering，SERS）因其靈敏度可達(dá)到單分子水平，特異性好以及對(duì)淬火不敏感性已廣泛用于致病菌檢測(cè)方面的研究[18]。目前大多數(shù)表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced raman scattering，SERS）生物傳感器都需要體積龐大的光學(xué)元件，如光學(xué)顯微鏡、激光器、單色儀和探測(cè)器等。因此，今后的研究應(yīng)著力于開發(fā)簡(jiǎn)單小型化的表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced raman scattering，SERS）生物傳感器。SERS 生物傳感器的另一個(gè)局限性是樣品中致病菌的定量檢測(cè)。這取決于SERS 的性質(zhì)，即拉曼信號(hào)的增強(qiáng)程度取決于金屬表面的納米級(jí)尺寸的粗糙度。Kang 等[23]研制了一種可作為特異且靈敏的多通路DNA 傳感器的金顆粒在線系統(tǒng)。由多個(gè)金納米線傳感器形成的圖案為每個(gè)傳感器提供相應(yīng)的位置與標(biāo)識(shí)。利用該系統(tǒng)，可以定量檢測(cè)目標(biāo)DNA，檢測(cè)限為10 pM。該傳感器系統(tǒng)成功地識(shí)別了參考致病菌與臨床分離物中的目標(biāo)物DNA，為傳染病的診斷提供了依據(jù)。Kearns 等[24]利用磁分離和SERS 技術(shù)，研制了一種分離和檢測(cè)多種致病菌的新型生物傳感器。這種新的檢測(cè)方法涉及到使用凝集素功能化磁性納米顆粒從樣品基質(zhì)中捕獲和分離細(xì)菌，然后使用SERS 活性納米顆粒特異性地檢測(cè)細(xì)菌病原體，其原理如圖4 所示。

圖4 基于SERS 的傳感器[24]Fig.4 The plasmonic biosensor based on the SERS[24]

此研究可檢測(cè)3 種致病菌單一和混合的樣品——大腸桿菌、傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，每種細(xì)菌的最低檢測(cè)限可達(dá)101 CFU/mL。這為未來的致病菌多重檢測(cè)的研究與發(fā)展提供了理論依據(jù)。致病微生物還可通過層次聚類分析來進(jìn)行識(shí)別。聚類分析是利用了細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分（多糖，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，核酸等）來顯示不同的SERS 譜的特征。因此，病原微生物不同的細(xì)胞壁成分使其SERS 光譜“特征”表現(xiàn)不同。但因?qū)Ψ治鲕浖椭虏【鷺?biāo)準(zhǔn)的表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced raman scattering，SERS）數(shù)據(jù)庫有較高要求，SERS 生物傳感器應(yīng)用于致病菌的檢測(cè)仍然任重而道遠(yuǎn)。

3 微流體光學(xué)生物傳感器

近年來，微流控技術(shù)的快速發(fā)展，使其被廣泛應(yīng)用于各種光學(xué)生物傳感器中用以檢測(cè)致病微生物。生物傳感器與微流體集成的檢測(cè)系統(tǒng)能夠在單一設(shè)備上進(jìn)行樣品的添加、分離、制備和分析，其具有成本低、檢測(cè)時(shí)間短、多通量、自動(dòng)化、便攜性，多功能性和所需樣品量小等多種優(yōu)點(diǎn)[25]。從復(fù)雜樣品中有效分離致病菌對(duì)于精確檢測(cè)病原體至關(guān)重要，同樣也是今后疾病控制和食品、環(huán)境監(jiān)控的需求。近年來，研究人員對(duì)集成光學(xué)生物傳感器越加重視。例如Lee 等[26]研發(fā)了一種利用磁性納米粒子組（magnetite nano clusters，MNCs）和三維印刷螺旋微通道裝置來檢測(cè)大腸桿菌的分析方法。用抗體功能化的磁性納米粒子組（magnetite nano clusters，MNCs）捕獲牛奶中的大腸桿菌，使用永久磁鐵將游離的MNCs 和MNC-菌體復(fù)合物從牛奶中分離出來，然后將該溶液注入螺旋微通道裝置中，通過分光光度法測(cè)定大腸桿菌的濃度，該方法緩沖液中檢測(cè)限為101CFU/mL，牛奶中檢測(cè)限為102CFU/mL。三維印刷螺旋微通道傳感器見圖5。

圖5 三維印刷螺旋微通道傳感器[26]Fig.5 The 3D-printed microfluidic biosensor device[26]

此外，科研工作者也努力研發(fā)自動(dòng)化與微型化的生物傳感器檢測(cè)系統(tǒng)。例如，Ramalingam 等[27]開發(fā)的能夠在微流控芯片中對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）進(jìn)行耦合的熒光傳感器能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)各種病原體的DNA，如圖6 所示。

圖6 熒光微流控芯片傳感器[27]Fig.6 Fluorescence microfluidic chip biosensor[27]

高精確控制溫度是微流控PCR 的一個(gè)重要研究課題，并且最近開發(fā)了基于微流體的等溫循環(huán)PCR 裝置，如核酸序列依賴性擴(kuò)增技術(shù)（nuclear acid sequence-based amplification，NASBA）和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification method，LAMP）[28-29]。在某些情況下，微流控裝置會(huì)被設(shè)計(jì)成多隔板式結(jié)構(gòu)，用于多重檢測(cè)不同的致病微生物。Foudeh 等[30]研發(fā)了一種針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌的快速、高特異性和靈敏性的檢測(cè)方法，主要是由于基因的16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過核糖體碎片和量子點(diǎn)增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，增加了檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度。此方法可以檢測(cè)菌體16S rRNA 基因溶液濃度為102pM，體系為45 002 μL 的樣品，可直接、即時(shí)、有效地檢測(cè)人工水系統(tǒng)中的嗜肺軍團(tuán)菌。目前，越來越多的研究者將無線網(wǎng)絡(luò)粘合劑裝置組裝在結(jié)構(gòu)化的電子微流控基底上來監(jiān)測(cè)生物傳感器的檢測(cè)結(jié)果，并將數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)傳輸?shù)绞謾C(jī)或計(jì)算機(jī)系統(tǒng)[31]。各種用于檢測(cè)致病菌的光學(xué)生物傳感器的研究實(shí)例見表1，各種用于檢測(cè)致病菌的光學(xué)生物傳感器的優(yōu)缺點(diǎn)及改進(jìn)措施見表2。

表1 各種用于檢測(cè)致病菌的光學(xué)生物傳感器的研究實(shí)例Table 1 Research examples of various optical biosensors for the detection of pathogenic bacteria

續(xù)表1 各種用于檢測(cè)致病菌的光學(xué)生物傳感器的研究實(shí)例Continue table 1 Research examples of various optical biosensors for the detection of pathogenic bacteria

表2 各種用于檢測(cè)致病菌的光學(xué)生物傳感器的優(yōu)缺點(diǎn)及改進(jìn)措施Table 2 Pros cons and improvement of various optical biosensors for detection of pathogenic bacteria

4 結(jié)論

目前，用于致病菌檢測(cè)的可視化集成光學(xué)生物傳感器已得到極大的發(fā)展，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，同時(shí)也存在一些尚未解決的問題。在高通量模式下應(yīng)用于大量臨床和環(huán)境樣本的致病菌檢測(cè)光學(xué)生物傳感器方面的文獻(xiàn)較少。此外，致病微生物的多樣性，使檢測(cè)系統(tǒng)難以有效地覆蓋全部目標(biāo)物。因此，開發(fā)高效的檢測(cè)系統(tǒng)是致病菌檢測(cè)與診斷發(fā)展的重要方向，需要科研人員不斷地探索與光學(xué)生物傳感器系統(tǒng)有關(guān)的各種新方法、新策略。例如，將已有的檢測(cè)方法與分析設(shè)備結(jié)合開發(fā)出更為先進(jìn)的診斷設(shè)備，提高其靈敏度與特異性，尤其是無線通信集成的光學(xué)生物傳感器在致病菌診斷系統(tǒng)應(yīng)用方面的前景非常可觀。基于新型納米技術(shù)的光學(xué)生物傳感器正推動(dòng)致病菌的檢測(cè)設(shè)備趨向于小型化、簡(jiǎn)單化、成本低廉、高通量和集成多元化發(fā)展。憑借可視化光學(xué)生物傳感器的諸多優(yōu)勢(shì)，這類傳感器必定會(huì)在臨床研究、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、病理分析、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域發(fā)揮巨大的應(yīng)用價(jià)值并在現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)中占有具有極其重要的地位。