基于金納米花標(biāo)記的免疫層析法檢測(cè)牛奶中黃曲霉毒素M1

金玉，劉仁榮，裘雪梅

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌330013）

黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）是由哺乳類動(dòng)物攝入被黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）污染的糧食或飼料后在動(dòng)物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，具有劇毒性和強(qiáng)致癌性[1]，2002年世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將AFM1列為一類致癌物[2]。國(guó)內(nèi)外對(duì)AFM1在牛奶及其制品中設(shè)定了比較嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟規(guī)定鮮奶、高溫消毒奶及奶制品中AFM1的含量不能超過(guò)0.05 μg/kg，對(duì)于嬰幼兒配方食品中AFM1限量標(biāo)準(zhǔn)為0.025 μg/kg。我國(guó)對(duì)牛奶和嬰幼兒奶粉中AFM1的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.5 μg/kg[3]。AFM1主要存在于國(guó)民飲食不可缺少的牛奶及其制品中[4]。所以對(duì)牛奶中AFM1含量的檢測(cè)非常必要。目前用于檢測(cè)AFM1的薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）[5-6]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[7-8]和酶聯(lián)免疫法吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[9]等方法需要繁瑣的操作步驟和較長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間才能得到檢測(cè)結(jié)果；膠體金或稱球形納米金（gold nanospherical，AuNSs）免疫層析檢測(cè)卡雖有快速簡(jiǎn)便易攜帶等優(yōu)點(diǎn)，但因?yàn)锳FM1的限量標(biāo)準(zhǔn)非常嚴(yán)格，30 nm 左右的AuNSs 因其光學(xué)亮度的不足很難提高目標(biāo)物的檢測(cè)靈敏度[10]，難以滿足檢測(cè)AFM1靈敏度要求[11-12]。金納米花（gold nanoflowers，AuNFs）相比于常用的球形納米金因其分支狀凸出于球體表面形成很強(qiáng)的電場(chǎng)效應(yīng)而表現(xiàn)出更強(qiáng)的光學(xué)消光系數(shù)[13-15]，且還有著更高的比表面積和復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)。因其分支結(jié)構(gòu)的特征可以使標(biāo)記過(guò)程中減少空間位阻，從而使目標(biāo)蛋白更容易在AuNF 表面上固定[16]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道使用AuNFs 作為探針提高了目標(biāo)物的檢測(cè)靈敏度[17-18]。本研究嘗試使用AuNFs 標(biāo)記AFM1單克隆抗體，研制了免疫層析檢測(cè)卡，其檢測(cè)靈敏達(dá)到12.3 pg/mL，檢測(cè)范圍為20 pg/mL～1 000 pg/mL，比球形納米金標(biāo)記的AFM1單抗制備的免疫層析檢測(cè)卡檢測(cè)限提高4.3 倍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二水合檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O）、三水合四氯金酸（HAuCl4·3H2O）、抗壞血酸鈉（C6H7NaO6）、牛血清白蛋白（BSA）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）20000、對(duì)苯二酚（C6H6O2）：sigma 公司；黃曲霉毒素 M1抗原、黃曲霉毒素M1單克隆抗體：江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室I 制備；硝酸纖維素膜HF135：美國(guó)Millipore 公司；樣品墊、結(jié)合物墊、吸水紙、底板：上海金標(biāo)生物科技有限公司；AFM1-ELISA：青島普瑞邦生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

電熱磁力攪拌器（GS7）：德國(guó)IKA 公司；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：Perkinelmer 公司；Multiskan MK3 酶標(biāo)儀、透射電子顯微鏡（FEI）：美國(guó) Thermo 公司；高速冷凍離心機(jī)（5804R）：德國(guó) Eppendorf 公司生產(chǎn)；XYZ-3D噴金劃膜儀HM3035、微自動(dòng)斬切機(jī)（ZQ2000）：上海金標(biāo)生物科技有限公司；Zeta Plus 粒度電位測(cè)試儀：美國(guó)BROOKHAVEN INSTUMENTS CORPORATON；納米金免疫分析讀數(shù)儀（GM60）：深圳科創(chuàng)志達(dá)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配置

1%檸檬酸三鈉溶液：稱取二水合檸檬酸三鈉0.5 g于燒杯中，加入50mL超純水中充分溶解；1%四氯金酸：稱取三水合四氯金酸1 g 于燒杯中，加入100 mL超純水充分溶解；1 mol/L 抗壞血酸鈉水溶液：稱取抗壞血酸鈉1.98 g 于燒杯中，加入10mL超純水充分溶解；0.03 mol/L 對(duì)苯二酚水溶液：稱取對(duì)苯二酚0.33 g于燒杯中，加入100mL超純水充分溶解。將4 種溶液過(guò) 0.22 μm 濾膜后備用。

1.3.2 AuNSs 和 AuNFs 的制備

AuNSs：取200mL超純水倒入裝有攪拌子的潔凈三角燒瓶中，在攪拌狀態(tài)下加熱至沸騰，加入1mL1%檸檬酸三鈉和200 μL 1 mol/L 抗壞血酸鈉，待溶液再次沸騰后，一次性準(zhǔn)確加入2mL的1%四氯金酸溶液，溶液在1 min 內(nèi)慢慢轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹萍t色，穩(wěn)定后開(kāi)始計(jì)時(shí)10 min，結(jié)束后攪拌冷卻至室溫。然后將冷卻的AuNSs 溶液過(guò)0.22 μm 濾膜，置于室溫，潔凈處備用。

AuNFs：在室溫?cái)嚢钘l件下，取100mL超純水倒入裝有攪拌子的潔凈三角燒瓶中，調(diào)節(jié)溶液pH 值為7.0±0.1，分別加入0.5mL1%四氯金酸水溶液、0.5mLAuNSs 和440 μL 1%檸檬酸三鈉水溶液，最后在三角瓶中加入1mL0.03 mol/L 的對(duì)苯二酚水溶液，室溫條件下反應(yīng)30 min，結(jié)束后攪拌冷卻至室溫。然后將冷卻的AuNFs 溶液過(guò)0.22 μm 濾膜，置于室溫，潔凈處備用。

1.3.3 金納米花 AFM1抗體（AuNF-AFM1-Mab）和的球形納米金AFM1抗體（AuNS-AFM1-Mab）標(biāo)記物的制備

AuNF-AFM1-Mab 的制備：取10mLAuNFs 于含有攪拌子的潔凈燒杯內(nèi)，加入40 μL 0.2 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)溶液pH 值，然后緩慢加入終濃度為4 μg/mL 的AFM1抗體。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30 min 后加入1mL5 %PEG20000 封閉30 min。反應(yīng)結(jié)束后將標(biāo)記溶液于離心機(jī)內(nèi)1 000 r/min，離心5 min，然后取上清液在10 000 r/min 條件下離心20 min，下層沉淀用1mL重懸液（5%海藻糖，0.5%BSA，0.5%甘氨酸，0.5%T-20 溶于10 mmol/L PBS）溶解。放置于2 ℃～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

AuNS-AFM1-Mab 的制備：取 10mLAuNSs 于含有攪拌子的潔凈燒杯內(nèi)，加入100 μL 0.2 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)溶液pH 值，然后緩慢加入終濃度為4 μg/mL 的AFM1抗體，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30 min。然后加入1mL10%BSA 封閉30 min。結(jié)束后將標(biāo)記溶液置于離心機(jī)內(nèi)900 g，離心5 min，然后取上清液在8 000 g 條件下離心30 min，下層沉淀用1mL重懸液溶解。放置于2 ℃～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 AFM1金納米花免疫層析檢測(cè)卡（AFM1-gold nanoflower immunochromatographic test card，AFM1-GFICT）和球形納米金免疫層析檢測(cè)卡（AFM1-gold nanospherical immunochromatographic test card，AFM1-GICT）的制備

將 AFM1-BSA（0.5 mg/mL）和山羊抗鼠（0.3 mg/mL）分別劃在NC 膜的T 和C 線位置。在預(yù)處理的結(jié)合物墊（5%蔗糖、0.5%T-20、溶于 2 mmol/L 硼酸緩沖液）上各噴AuNS-AFM1-Mab 和AuNF-AFM1-Mab 標(biāo)記物的量為2 μL/cm。將玻璃纖維切割成300 mm×18 mm大小，用樣品墊預(yù)處理液（0.5%Tetronic1307、0.5%BSA 溶于 20 mmol/L PBS，pH 值 7.5±0.1） 將玻璃纖維浸透10 min。將上述制備好的組分置于37 ℃，相對(duì)濕度小于或等于35%的恒溫箱內(nèi)干燥備用。將結(jié)合物墊、樣品墊和NC 膜組裝成大板[19]。把大板切成65 mm×3.95 mm 的測(cè)試條裝入WE-2 塑料卡內(nèi)組裝成檢測(cè)卡。

1.3.5 AFM1-GFICT 和AFM1-GICT 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在相同AFM1抗原和AFM1抗體用量條件下制備AFM1-GFICT 和AFM1-GICT。測(cè)量不含AFM1的空白牛奶（篩選過(guò)程參考GB 5009.24-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素M 族的測(cè)定》[20]，以下空白牛奶均為此樣品）中加入AFM1標(biāo)準(zhǔn)品為下列濃度（0、10、20、50、100、200、300、500、900、1 000、2 700、5 400 pg/mL）的樣品，用納米金免疫分析讀數(shù)儀讀取上述12 個(gè)樣品的信號(hào)值。以加標(biāo)AFM1樣品濃度為X 軸，測(cè)量信號(hào)值為Y 軸繪制非線性四參數(shù)擬合曲線。根據(jù)擬合方程式求出每個(gè)信號(hào)值對(duì)應(yīng)AFM1的濃度，將AFM1標(biāo)稱濃度和反求濃度做直線擬合，當(dāng)直線擬合系數(shù)R2大于0.99時(shí)說(shuō)明此系列加標(biāo)AFM1樣品濃度的非線性四參數(shù)擬合曲線用于牛奶樣品的測(cè)量有較好的準(zhǔn)確度。計(jì)算AFM1-GFICT 和 AFM1-GICT 的檢測(cè)限（limit of detection，LOD）定義為：分別用 AFM1-GFICT 和 AFM1-GICT檢測(cè)不含AFM1的牛奶樣品，重復(fù)檢測(cè)20 次，得到20次測(cè)量的信號(hào)值，計(jì)算其平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），得出M-2SD 所對(duì)應(yīng)的信號(hào)值，根據(jù)AFM1-GFICT 和AFM1-GICT 非線性四參數(shù)擬合方程，將M-2SD 所對(duì)應(yīng)的信號(hào)值代入上述擬合方程求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即為其LOD。

1.3.6 AFM1-GFICT 分析性能評(píng)估

1.3.6.1 準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

選擇空白牛奶樣品，分別加入AFM1標(biāo)準(zhǔn)品使其濃度分別為 0.1、0.3、0.5 μg/kg，用室溫和 37 ℃放置 30 d的AFM1-GFICT 對(duì)3 個(gè)水平的加標(biāo)樣品檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)10 次。計(jì)算測(cè)量平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，求出回收率和變異系數(shù)。

1.3.6.2 特異性評(píng)價(jià)

選擇AFM1的結(jié)構(gòu)類似物AFB1和其他3 種常見(jiàn)真菌毒素（嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素）來(lái)計(jì)算AFM1-GFICT 與它們的交叉反應(yīng)率。

交叉反應(yīng)率/%=AFM1-EC50/分析物-EC50×100

式中：EC50表示半最大效應(yīng)濃度，pg/mL。

將AFB1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素分別配置濃度為 0、50、100、200、500、1 000、2 000、5 400 pg/mL，用AFM1-GFICT 對(duì)4 種真菌毒素系列濃度檢測(cè)。

1.3.6.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

從樂(lè)買佳超市購(gòu)買了5 種不同品牌的純牛奶、5種不同品牌的生鮮奶和3 種不同品牌的奶粉。從生工生物工程（上海）有限公司購(gòu)買2 批次的工業(yè)脫脂奶粉各1 瓶。上述純牛奶直接用AFM1-GFICT 進(jìn)行檢測(cè)；奶粉檢測(cè)過(guò)程為：稱取3 g 奶粉，加入30mL10%甲醇水振蕩混勻5 min 后，置于離心機(jī)內(nèi)6 000 r/min，離心5 min，取上清用AFM1-GFICT 進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AuNFs和AuNSs的表征

AuNFs 和 AuNSs 的 （ultraviolet and visible spectrophotometry，UV）掃描圖見(jiàn)圖1。

圖1 AuNFs 和 AuNSs 的 UV 掃描圖Fig.1 UV absorption spectrum of AuNSs and AuNFs

金納米粒子的形態(tài)和粒徑?jīng)Q定了其膠體的穩(wěn)定性，顏色，最大吸收峰，AuNSs 的最大吸收峰528 nm，峰窄而平滑，說(shuō)明其分散性良好，顆粒均勻；AuNFs 最大吸收峰為735 nm，表明此AuNFs 相對(duì)粒徑大，分支狀數(shù)量較多；經(jīng)過(guò)粒度儀測(cè)量AuNFs 的有效粒徑為（91.8±0.8）nm，AuNSs 的有效粒徑為（30.5±0.3）nm。

AuNSs 和AuNFs 的實(shí)物圖及透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）照片見(jiàn)圖2。

圖2 AuNFs 和AuNSs 實(shí)物照片和AuNFs 透射電鏡掃描照片F(xiàn)ig.2 Photographic images of AuNFs and AuNSs and TEM images of AuNFs

圖2 AuNSs、AuNFs 實(shí)物照片和透射電鏡掃描照片F(xiàn)ig.2 AuNSs，AuNFs physical pictures and transmission electron microscope images

AuNFs 和AuNSs 的結(jié)構(gòu)和形態(tài)表明，AuNSs 是球形金納米粒子，而AuNFs 在實(shí)心的球形金納米粒子表面生長(zhǎng)出幾個(gè)到10 幾個(gè)邊緣平滑的分支狀凸出，兩種顆粒分散性良好。

AuNFs 的Zeta 電位測(cè)量結(jié)果見(jiàn)圖3。

AuNFs 的 Zeta 電位為（-41.6±1.6）mV，理論上Zeta電位絕對(duì)值大于30 mV 時(shí)粒子有較好的穩(wěn)定性[21]，將AuNFs 放置于室溫存儲(chǔ)12 個(gè)月，AuNFs 沒(méi)有發(fā)生集聚，說(shuō)明此AuNFs 有較好的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)表明AuNFs和AuNSs 可用于標(biāo)記單克隆抗體。

圖3 AuNFs 的 Zeta 電位Fig.3 Zeta potential of AuNFs

2.2 AuNFs標(biāo)記AFM1-Mab最佳標(biāo)記pH值和最合適標(biāo)記蛋白質(zhì)濃度

AuNF 標(biāo)記AFM1抗體的pH 值優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 AuNF 標(biāo)記AFM1抗體的pH 值優(yōu)化Fig.4 Optimize the pH of the AuNF-labeled AFM1-Mab

取空白牛奶樣品配置AFM1濃度為0.3 ng/mL 的陽(yáng)性樣品，在不同pH 值用AuNFs 標(biāo)記AFM1-Mab 制備免疫層析檢測(cè)卡，用于檢測(cè)空白牛奶和陽(yáng)性牛奶樣品，反應(yīng)20 min 后用納米金免疫分析讀數(shù)儀讀取T/C的信號(hào)值，定義陽(yáng)性T/C 信號(hào)值除以陰性T/C 信號(hào)值為此pH 值下的T 線抗原AFM1-BSA 與AuNF-AFM1-Mab 的結(jié)合率，結(jié)合率越低說(shuō)明此時(shí)阻斷情況越好，靈敏度越高，抗原與抗體的反應(yīng)更徹底，結(jié)合在AuNF 上的抗體活性最好，當(dāng)在 2mLAuNFs 中加入 8 μL～10 μL 0.2 mol/L K2CO3時(shí)，此時(shí)陰性信號(hào)值與陽(yáng)性信號(hào)值差值較大，結(jié)合率較低，說(shuō)明此時(shí)標(biāo)記在AuNF 上的抗體活性最好，所以此AuNF 標(biāo)記AFM1的最合適標(biāo)記pH 值為在 1mLAuNFs 中加入 4 μL～5 μL 的 0.2 mol/L K2CO3。

AuNF 標(biāo)記AFM1抗體的濃度優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖5。

在優(yōu)化好的pH 值下，在1mLAuNFs 中加入4 μg/mL AFM1抗體時(shí)，此時(shí)陰性信號(hào)值與陽(yáng)性信號(hào)值差值較大，結(jié)合率最低，即為AuNFs 最佳標(biāo)記蛋白質(zhì)濃度。

2.3 AFM1-GFICT關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化

AFM1-GFICT 反應(yīng)體系的pH 值、離子強(qiáng)度和表面活性劑優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖5 AuNF 標(biāo)記AFM1抗體的濃度優(yōu)化Fig.5 Optimize the concentration of AuNF-labeled AFM1-Mab

調(diào)節(jié)反應(yīng)體系 pH 值為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5，分別用AFM1-GFICT 檢測(cè)用空白牛奶配置的0、0.3 ng/mL 的樣品，圖中每2 個(gè)相連的卡為一組條件的檢測(cè)結(jié)果，顯色結(jié)果表明：pH 值在7.5～8.0，陰性和陽(yáng)性顯色對(duì)比較明顯，離子強(qiáng)度為20 mmol/L PBS 陰性和陽(yáng)性顯色對(duì)比較明顯，表面活0.5%Tetronic-1307條件下陰性和陽(yáng)性顯色對(duì)比較明顯。

AFM1-GFICT 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線見(jiàn)圖7。

AFM1-GFICT 檢測(cè)空白牛奶樣品和用其配置AFM1為0.1ng/mL 的樣品，從10 min 開(kāi)始計(jì)時(shí)到38 min結(jié)束，每分鐘測(cè)量一次它們的信號(hào)值。數(shù)據(jù)表明，當(dāng)反應(yīng)在20 min～25 min 時(shí)，其信號(hào)值無(wú)明顯差別，所以選擇AFM1-GFICT 最佳讀數(shù)時(shí)間為20 min～25 min。

圖6 優(yōu)化AFM1-GFICT 反應(yīng)體系的pH 值、離子強(qiáng)度和表面活性劑Fig.6 Optimizes the pH，ionic strength and surfactant of the AFM1-GFICT reaction system

圖7 AFM1-GFICT 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線Fig.7 AFM1-GFICT reaction kinetics curves

2.4 AFM1-GFICT和AFM1-GICT定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

AFM1-GFICT 檢測(cè) AFM1濃度 0～1 000 pg/mL 樣品的顯色結(jié)果和其非線性四參數(shù)曲線擬合見(jiàn)圖8 和圖9。

可以看出從0 到1 000 pg/mL 顯色有明顯梯度，AFM1-GFICT 在 20 pg/mL～1 000 pg/mL 時(shí)反求濃度與標(biāo)稱濃度直線擬合R2=0.999 8，非線性四參數(shù)曲線擬合相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，EC50（半最大效應(yīng)濃度）=68.5 pg/mL，計(jì)算出最低檢測(cè)限為12.3 pg/mL。

圖8 AFM1-GFICT 檢測(cè)含 AFM1濃度 0～1 000 pg/mL 樣品的顯色Fig.8 AFM1-GFICT detects AFM1concentration 0～1 000 pg/mL color development result

圖9 AFM1-GFICT 非線性四參數(shù)曲線擬合Fig.9 AFM1-GFICT nonlinear four-parameter curve fitting

AFM1-GICT 檢測(cè) AFM1濃度 0～5 400 pg/mL 樣品的顯色結(jié)果和其非線性四參數(shù)曲線擬合見(jiàn)圖10 和圖11。

圖10 AFM1-GICT 檢測(cè)含AFM1濃度0～5 400 pg/mL 樣品的顯色結(jié)果Fig.10 AFM1-GICT detects AFM1concentration 0～5 400 pg/mL color development result

圖11 AFM1-GICT 非線性四參數(shù)曲線擬合Fig.11 AFM1-GICT nonlinear four-parameter curve fitting

可以看出從0 到5 400 pg/mL 顯色有明顯梯度，AFM1-GICT 在 100 pg/mL～5 400 pg/mL 時(shí)反求濃度與標(biāo)稱濃度直線擬合R2=0.999 0，非線性四參數(shù)曲線擬合相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，EC50=305.0 pg/mL，計(jì)算出最低檢測(cè)限為53.0 pg/mL。檢測(cè)結(jié)果表明在同樣抗原和抗體用量時(shí)AFM1-GFICT 的最低檢測(cè)限比AFM1-FICT高4.3 倍。表明用AuNFs 作為檢測(cè)信號(hào)的放大有利于提高免疫層析檢測(cè)試劑的靈敏度。

2.5 AFM1-GFICT分析性能評(píng)估

2.5.1 AFM1-GFICT 加標(biāo)回收、精密度和穩(wěn)定性測(cè)試

AFM1-GFICT 準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

數(shù)據(jù)表明室溫放置AFM1-GFICT 的加標(biāo)回收率在80.4%～118.2%之間，變異系數(shù)在4.27%～9.43%，37 ℃放置AFM1-GFICT 的加標(biāo)回收率在81.5%～113.0%之間，變異系數(shù)在8.9%～11.9%，表明AFM1-GFICT 有較好的準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性。

2.5.2 AFM1-GFICT 特異性

AFB1非線性四參數(shù)擬合EC50為 152.45 pg/mL，AFM1-GFICT 與其交叉反應(yīng)率為44.9%，而其他3 種真菌毒素不能進(jìn)行非線性四參數(shù)擬合，說(shuō)明其在5.4 ng/mL時(shí)無(wú)明顯阻斷，說(shuō)明AFM1-GFICT 與它們的交叉反應(yīng)率小于1%。

表1 AFM1-GFICT 準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果Table 1 AFM1-GFICT ccuracy，precision and stability test results

2.5.3 AFM1-GFICT 與商業(yè)化AFM1-ELISA 試劑盒檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性

AFM1-GFICT 與AFM1-ELISA 檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性見(jiàn)圖12。

圖12 AFM1-GFICT 與AFM1-ELISA 檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性Fig.12 Correlation between AFM1-GFICT test results and AFM1-ELISA test results

5 份不同品牌的液態(tài)奶、5 份不同品牌的生鮮乳及5 種不同類型的奶粉同時(shí)用AFM1-GFICT 與AFM1-ELISA 檢測(cè)，兩種方法的測(cè)量結(jié)果線性擬合方程y=1.68+0.95x（R2=0.976 8），表明 AFM1-GFIT 與 AFM1-ELISA 有較好的相關(guān)性。

3 結(jié)論

AuNFs 作為標(biāo)記物比AuNSs 運(yùn)用于免疫層析試驗(yàn)檢測(cè)牛奶樣品中的AFM1能夠有效的提高5 倍左右的檢測(cè)限。配合納米金免疫分析讀數(shù)儀，AFM1-GFICT在20 pg/mL～1 000 pg/mL 用非線性四參數(shù)曲線擬合時(shí)相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，其最低檢測(cè)限為12.3 pg/mL，能夠適應(yīng)歐盟等國(guó)家對(duì)牛奶樣品中AFM1檢測(cè)要求。在不含 AFM1的牛奶樣品中添加 0.1、0.3、0.5 μg/kg 的 AFM1標(biāo)準(zhǔn)品，其回收率分別為80.4%、99.3%和118.2%，每個(gè)加標(biāo)濃度重復(fù)檢測(cè)10 次的變異系數(shù)分別為9.43%、8.34 %和4.27 %。15 份牛奶樣品的AFM1-GFICT 和AFM1-ELISA 檢測(cè)結(jié)果相比，線性擬合相關(guān)系數(shù)R2=0.976 8。上述結(jié)果表明AFM1-GFICT 有較好的準(zhǔn)確度、精密度和較高的靈敏度，可為檢測(cè)牛奶及其制品中AFM1的污染提供靈敏高效準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。