QuEChERS EMR-Lipid技術(shù)結(jié)合LC/MS/MS快速篩查與確證豬肉中55種獸藥殘留

黃澤瑋,閔宇航,杜 鋼,黃 瑛,王 穎,劉忠瑩

(四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院,四川成都 611731)

食品安全是食品工業(yè)健康快速發(fā)展的前提,而目前我國(guó)食品安全問(wèn)題卻不容樂(lè)觀,其中獸藥殘留問(wèn)題嚴(yán)重危害著公共衛(wèi)生安全及人體健康[1]。獸藥的種類有很多,主要包括促生長(zhǎng)素、抗生素類、抗寄生蟲類等多種藥物,其在預(yù)防、治療、診斷動(dòng)物疾病中發(fā)揮重要作用。過(guò)量殘留的獸藥可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體內(nèi),對(duì)人體健康造成損傷[2]。因此嚴(yán)格監(jiān)控動(dòng)物源性食品中獸藥殘留具有重要意義。

隨著獸藥濫用越來(lái)越嚴(yán)重,檢驗(yàn)人員也面臨巨大的挑戰(zhàn):每檢驗(yàn)幾個(gè)或一類化合物就需要更換一種前處理方法和檢測(cè)方法,耗費(fèi)極大的人力、物力、財(cái)力和時(shí)間。同時(shí)動(dòng)物源性食品種類多,基質(zhì)復(fù)雜且差異大,檢測(cè)對(duì)象多,是食品中獸藥殘留處理和檢測(cè)的難題。近年來(lái),獸殘檢測(cè)的相關(guān)文獻(xiàn)中,前處理方法主要有:固-液萃取法[3-4]、固相萃取法[5-7]、、基質(zhì)固相分散技術(shù)[8-10]和QuEChERS[11-13]等,檢測(cè)技術(shù)有:高效液相色譜法[14-15]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16-17]、液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法[18-19]等。其中近兩年新推出的增強(qiáng)型除脂分散凈化劑(Enhanced Matrix Removal-Lipid,EMR-Lipid)是一種根據(jù)油脂類成分及大多數(shù)目標(biāo)分析物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)的增強(qiáng)型脂質(zhì)去除的QuEChERS凈化材料,對(duì)長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)物質(zhì)(如磷脂、游離脂肪酸、甘油三酯等)具有強(qiáng)大的吸附作用,能有效降低高脂肪含量基質(zhì)對(duì)目標(biāo)成分的干擾[20]。目前該技術(shù)還未見(jiàn)用于豬肉中多獸殘檢測(cè)的報(bào)道。

本文選擇了55種易出現(xiàn)濫用的獸藥(包括喹諾酮類抗生素、磺胺類抗生素、頭孢類抗生素、β-受體激動(dòng)劑、抗寄生蟲藥等)作為研究對(duì)象,以豬肉作為研究基質(zhì),運(yùn)用QuEChERS EMR-Lipid結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用,建立豬肉中55種獸藥殘留的快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿苯達(dá)唑-2-氨基砜、2-氨基氟苯咪唑、5-羥基甲苯咪唑、阿維菌素、阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、金剛烷胺、噻苯咪唑酯、頭孢孟多鋰、頭孢他美酯、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢噻呋、環(huán)丙沙星、克倫特羅、氯羥吡啶、氯丙那林、丹諾沙星、雙氟沙星、恩諾沙星、依普菌素、芬苯達(dá)唑、倍硫磷亞砜、氟羅沙星、氟甲喹、甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑、萘啶酸、奧比沙星、奧芬達(dá)唑砜、奧苯達(dá)唑、惡喹酸、培氟沙星、噴布特羅、吡羅昔康、普萘洛爾、沙拉沙星、司帕沙星、磺胺苯酰、磺胺氯吡嗪、磺胺二甲氧嗪、磺胺二甲異噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲基異噁唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺喹惡啉、替諾昔康、三氯苯達(dá)唑、妥布特羅、泰樂(lè)菌素 標(biāo)準(zhǔn)品,阿爾塔科技有限公司,濃度為100 μg/mL,溶劑為甲醇;乙腈、醋酸銨 色譜級(jí),飛世爾化學(xué)(Fisher Chemical);甲酸 優(yōu)級(jí)純,上海安譜科學(xué)儀器有限公司(Anpel);增強(qiáng)型除脂分散凈化管(EMR-Lipid dSPE,1 g/15 mL)、增強(qiáng)型除脂萃取鹽包(EMR polish,3.5 g)、陶瓷均質(zhì)子 美國(guó)安捷倫科技公司(Agilent)。

1290-6460超高壓液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫科技公司(Agilent);CP225D電子分析天平 德國(guó)賽多利斯公司(Sartorius);MULTIFUGE X3R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾公司(Thermo Fisher);TurboVap LV全自動(dòng)氮吹濃縮儀 美國(guó)拜泰齊公司(Biotage);MS3漩渦混勻儀 德國(guó)艾卡儀器設(shè)備有限公司(IKA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液相條件 色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×3.0 mm,1.8 μm),流速0.5 mL/min。流動(dòng)相為0.2%甲酸水溶液(A相)-0.2%甲酸乙腈(B相),梯度洗脫:0 min(A相98%:B相2%,后同)→0.5 min(98∶2)→1.8 min(85∶15)→3.5 min(80∶20)→6 min(75∶25)→7 min(70∶30)→11 min(65∶35)→16 min(0∶100)→26 min(0∶100)→27 min(98∶2)→30 min(98∶2);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:15 μL。

1.2.2 液相條件的優(yōu)化

1.2.2.1 流動(dòng)相的選擇 通過(guò)查閱文獻(xiàn)[21-23],在多獸殘分析中,普遍采用水-乙腈體系作為流動(dòng)相,另外添加少量的易揮發(fā)酸可提高離子化效率,改善峰性。因此分別考察了0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈、0.2%甲酸水溶液-0.2%甲酸乙腈、0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨溶液-0.1%甲酸乙腈這3種流動(dòng)相對(duì)各化合物峰性及響應(yīng)的影響。

1.2.2.2 色譜柱的選擇 為了獲得最佳的分離效果和最短的分離時(shí)間,考察Thermo Acclaim RSLC C18(100 mm×2.1 mm,2.2 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)和 Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×3.0 mm,1.8 μm)三款色譜柱對(duì)待測(cè)化合物的分離效果。

1.2.2.3 梯度洗脫的優(yōu)化 通過(guò)調(diào)節(jié)梯度,優(yōu)化各化合物的出峰,同時(shí)對(duì)同分異構(gòu)體進(jìn)行分離。存在的三組同分異構(gòu)體分別為磺胺甲氧噠嗪與磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嗪與磺胺二甲異噁唑以及吡羅昔康與奧芬達(dá)唑砜。

1.2.3 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(Electron Spray Ionization,ESI),正離子模式,檢測(cè)方式為dMRM,電離電壓為3.5 kV,干燥氣流速為13 L/min,干燥氣溫度為150 ℃,鞘氣流速為12 L/min,鞘氣溫度為300 ℃,霧化器流量為35 psi。各化合物質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 55種化合物質(zhì)譜參數(shù)

續(xù)表

1.2.4 樣品前處理

1.2.4.1 提取 稱取勻質(zhì)后的豬肉約5 g,于50 mL具蓋塑料離心管中,先加入10.0 mL 提取試劑,再加入兩粒陶瓷均質(zhì)子,渦旋(2000 r/min)混勻 5 min,離心5 min(4000 r/min)。

通過(guò)查閱文獻(xiàn)[25-27],多獸殘分析中多采用乙腈、甲醇等有機(jī)試劑作為提取試劑,對(duì)高脂肪高蛋白的基質(zhì)可有效提取目標(biāo)化合物,降低基質(zhì)的干擾。與甲醇相比,乙腈提取時(shí)帶入的極性干擾物更少,有利于后續(xù)凈化。由于大部分目標(biāo)化合物多帶有含氮基團(tuán),具有一定弱堿性,在提取溶劑中適量添加甲酸可提高這類化合物的提取效率。通過(guò)實(shí)驗(yàn)考察1%、2%、5%、8%甲酸乙腈對(duì)55種化合物的提取效率。

1.2.4.2 凈化 參考文獻(xiàn)[28],移取5.0 mL離心后上層提取液到已活化的EMR-Lipid dSPE管(活化方式:移取5.0 mL 5 mmol/L醋酸銨水溶液到15 mL EMR-Lipid dSPE管中,快速振搖并渦旋2 min(2000 r/min),即可),快速振搖并渦旋2 min(2000 r/min),離心5 min(4000 r/min),將上層液完全傾倒入50 mL離心管中,加入兩粒陶瓷均質(zhì)子及EMR polish粉包,快速劇烈振搖并渦旋2 min(2000 r/min),離心5 min(4000 r/min)。

1.2.4.3 濃縮 精密移取2 mL上層乙腈液至12 mL氮吹管中,加入0.050 mL二甲亞砜,40 ℃下氮?dú)鉂饪s至約0.050 mL;用15%乙腈水溶液補(bǔ)齊至1 mL,渦旋10 s(2000 r/min),超聲10 s,渦旋1 min(2000 r/min);將溶液倒入1.5 mL離心管中,離心2 min(10000 r/min),移取上層液至進(jìn)樣小瓶中,待分析。

1.2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.5.1 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取55種化合物的標(biāo)準(zhǔn)品各100 μL,置于同一10 mL量瓶中,加乙腈稀釋至刻度,作為混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液(各化合物濃度為1000 ng/mL)。分別精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0、5、25、50、100、500、1000 μL至50 mL離心管中(最終濃度分別為0、1.25、6.25、12.5、25、125、250 ng/mL),氮?dú)獯抵两伞＿x取陰性豬肉作為空白基質(zhì),分別稱取7份(每份5 g),置于上述已加入標(biāo)準(zhǔn)品的離心管中,然后按照樣品前處理方法進(jìn)行操作。以各化合物濃度為橫坐標(biāo),各化合物定量離子峰面積為縱坐標(biāo),繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.2 定量限考察 在確定定量限的研究中,在保證準(zhǔn)確定性的前提下,以空白基質(zhì)將混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液分別稀釋至10、5、2.5、1.25、0.625 ng/mL來(lái)考察定量限。將擬定的定量限通過(guò)加標(biāo)回收的方式考察定性結(jié)果、精密度和回收率,在保證定性準(zhǔn)確、絕大部分化合物精密度<15%、回收率70%～130%之間的前提下確定定量限。

1.2.6 考察準(zhǔn)確性與重復(fù)性 以豬肉作為基質(zhì),進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。按照1、10、100 μg/kg三水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),各水平制樣6份。準(zhǔn)確性以測(cè)出量對(duì)理論添加量的百分比值計(jì)算平均回收率表示,重復(fù)性以測(cè)出量的RSD表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將獲得的數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Agilent MassHunter Quantitative Analysis(for QQQ)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以化合物保留時(shí)間作為篩查依據(jù),以離子對(duì)豐度比作為確證依據(jù),進(jìn)行定性判斷;通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后,將樣品中各化合物峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線后獲得各化合物的濃度,以獲得定量結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相條件及優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇 通過(guò)比較3種流動(dòng)相:0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈、0.2%甲酸水溶液-0.2%甲酸乙腈,0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨溶液-0.1%甲酸乙腈,其中添加了甲酸銨后部分化合物會(huì)出現(xiàn)峰性變差的情況;0.2%甲酸體系中各化合物的響應(yīng)和分離效果普遍優(yōu)于0.1%甲酸體系。因此最終采用含0.2%甲酸溶液-0.2%甲酸乙腈作為流動(dòng)相。

2.1.2 色譜柱的選擇 對(duì)比三款色譜柱,前兩款的分析時(shí)間均較短,但由于出峰靠前的化合物(如雙氟沙星)峰性變差,而Agilent Eclipse Plus C18對(duì)55種化合物均有良好的峰性,因此選其作為分析柱。

2.1.3 梯度洗脫的優(yōu)化 通過(guò)調(diào)節(jié)梯度,對(duì)三組同分異構(gòu)體進(jìn)行分離。其中吡羅昔康和奧芬達(dá)唑砜產(chǎn)生的二級(jí)碎片均不同,不會(huì)相互影響定性和定量。但其他兩組由于均為磺胺類化合物,會(huì)產(chǎn)生相同的碎片。因此在設(shè)計(jì)梯度洗脫時(shí),需考慮這兩組化合物的完全分離。前11 min,選擇使用較緩的梯度以使這兩組化合物徹底分離。同時(shí),由于55種化合物中44種均在前11 min出峰,11 min后將梯度在5 min之內(nèi)升到有機(jī)相比例100%,并保持10 min,使難洗脫的化合物和基質(zhì)均能洗脫出來(lái),避免對(duì)后續(xù)進(jìn)樣的干擾。圖1為該條件下總離子流圖,可見(jiàn)在此色譜條件下,55種化合物均分離較好。

圖1 55種化合物總離子流圖

2.2 質(zhì)譜條件

根據(jù)歐盟2002/657/EC法案,質(zhì)譜確證需最低4個(gè)識(shí)別點(diǎn)數(shù)。對(duì)于低分辨質(zhì)譜,母離子的識(shí)別點(diǎn)數(shù)記為1,每個(gè)特征子離子識(shí)別點(diǎn)數(shù)記為1.5,因此,需至少1個(gè)母離子和2個(gè)子離子才能滿足4個(gè)識(shí)別點(diǎn)數(shù)的要求。由于在實(shí)際的樣品加標(biāo)中存在基質(zhì)對(duì)部分化合物定性造成的干擾,包括阿維菌素、阿苯達(dá)唑砜、金剛烷胺等20種化合物。因此這部分化合物選擇了1個(gè)母離子和3個(gè)二級(jí)子離子以確保定性的準(zhǔn)確。

圖2 丹諾沙星提取離子流圖

圖3 丹諾沙星質(zhì)譜圖

圖4 磺胺二甲嘧啶提取離子流圖

圖5 磺胺二甲嘧啶質(zhì)譜圖

2.3 樣品前處理

考察1%、2%、5%和8%的甲酸乙腈對(duì)各化合物的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5%甲酸乙腈作為提取溶劑,大部分化合物回收率均在70%～120%之間。而當(dāng)酸度較低或過(guò)高時(shí),磺胺類化合物回收率均會(huì)偏低。

圖6 不同酸度對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性與定量限 由線性及定量限結(jié)果(見(jiàn)表2)顯示,各化合物在1.25～250 ng/mL線性范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)r均≥0.998。定量限均為1 μg/kg。本實(shí)驗(yàn)未采用信噪比的方式來(lái)確定定量限,原因在于磺胺甲基異噁唑、磺胺甲基嘧啶、氯羥吡啶等化合物在信噪比為10時(shí),定性結(jié)果出現(xiàn)假陰性的情況,同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)回收率和精密度不能滿足定量分析的要求的情況,比如磺胺甲基嘧啶回收率僅48%,RSD僅32%。

表2 55種化合物線性、定量限、準(zhǔn)確度及精密度

續(xù)表

2.4.2 準(zhǔn)確性與重復(fù)性 結(jié)果見(jiàn)表2,95%化合物各添加水平的平均回收率為70.0%～130.0%,94%化合物重復(fù)性<15%;全部化合物的回收率為60.5%～139.5%,RSD為1.0%～20.1%。方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性均滿足定量分析的要求。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

在市場(chǎng)上采購(gòu)豬肉18批次,按照所建立的方法進(jìn)行測(cè)試,結(jié)果未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品。

3 結(jié)論

本文首次將QuEChERS EMR-Lipid與LC/MS/MS聯(lián)用技術(shù)用于豬肉中多獸藥殘留的快速篩查和確證。采用5%甲酸乙腈作為提取溶劑,經(jīng)EMR-Lipid凈化后,通過(guò)Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×3.0 mm,1.8 μm)在30 min內(nèi)完成對(duì)55 種化合物的分離,由液質(zhì)聯(lián)用儀在正離子及dMRM模式下采集數(shù)據(jù),最終由數(shù)據(jù)處理軟件通過(guò)保留時(shí)間及離子對(duì)豐度比進(jìn)行快速篩查和確證,并采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。所建立的多獸殘分析方法,在1.25～250 ng/mL范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)r均≥0.998,定量限均為1 μg/kg,在1～100 μg/kg加標(biāo)回收中,回收率在60.5%～139.5%,RSD在1.0%～20.1%,準(zhǔn)確度和重復(fù)性符合定量分析的要求。本方法可實(shí)現(xiàn)同時(shí)分析55種獸殘化合物,大大提高了檢驗(yàn)效率,為檢驗(yàn)人員提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、快捷、高效的檢驗(yàn)方法,也為食品安全提供了技術(shù)保障。