表面增強(qiáng)拉曼光譜測(cè)定保健品中非法添加物西地那非

吳國(guó)萍,周亞紅,李靜泉,李家偉

(1.江蘇警官學(xué)院刑事技術(shù)系,江蘇南京 210031)2.江蘇省食品藥品與環(huán)境犯罪技術(shù)檢驗(yàn)工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210031)

5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑主要作用是抑制磷酸二酯酶的活性,常用于治療勃起障礙,同時(shí)也有助于高血壓、充血性心力衰竭、冠狀動(dòng)脈疾病和心絞痛的治療,屬于處方藥品;服用后會(huì)產(chǎn)生諸如頭痛、潮紅、消化不良、視覺(jué)異常、血壓重疊下降等不良反應(yīng)[1]。根據(jù)《中華人民共和國(guó)食品安全法》規(guī)定,向食品、保健品中添加此類物質(zhì)屬于違法行為,公安機(jī)關(guān)食藥環(huán)偵部門(mén)對(duì)保健品中非法添加化學(xué)成分的打擊一直處于高壓態(tài)勢(shì)。但是,保健食品及補(bǔ)腎壯陽(yáng)類中成藥中非法添加5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑(如西地那非、他達(dá)拉非等)的現(xiàn)象層出不窮。

目前,對(duì)5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑相關(guān)檢測(cè)的5項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)如國(guó)家藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件2009030、食藥監(jiān)[2016]28號(hào)文附件7和國(guó)家食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法BJS201601、BJS201704、BJS201710都是運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[1-5]。液質(zhì)聯(lián)用的檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確度高,靈敏度高;但分析周期比較長(zhǎng),儀器昂貴,操作復(fù)雜[6-10],在公安實(shí)戰(zhàn)部門(mén)普及率不高。公安食藥環(huán)偵部門(mén)對(duì)功能性保健品中非法添加成分的檢驗(yàn)是快檢、初篩為陽(yáng)性結(jié)果的協(xié)調(diào)相關(guān)檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行確證性檢驗(yàn)。建立功能性保健品中違禁法成分的快速、準(zhǔn)確篩查方法,能有利于公安食藥環(huán)偵部門(mén)主動(dòng)發(fā)現(xiàn)線索。便攜拉曼光譜具有快速、無(wú)損、可定量、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn),表面增強(qiáng)技術(shù)(SERS)利用納米尺度的粗糙表面或顆粒體系具有的異常光學(xué)增強(qiáng)效應(yīng),使吸附在材料表面的分子拉曼信號(hào)能提高104～107,表面增強(qiáng)結(jié)合拉曼技術(shù)可以提供其他檢測(cè)技術(shù)所達(dá)不到的檢測(cè)水平,在快檢行業(yè)受到越來(lái)越多的關(guān)注[11-20]。但文獻(xiàn)資料的查閱表明,國(guó)內(nèi)關(guān)于拉曼表面增強(qiáng)快速檢驗(yàn)?zāi)欠穷愇镔|(zhì)的報(bào)道相對(duì)較少,僅見(jiàn)王紅梅等[21]采用表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)西地那非類藥物的快速檢測(cè)和劉元瑞等[22]采用薄層原位表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測(cè)中成藥和保健品中添加的西地那非。

國(guó)內(nèi)便攜拉曼光譜儀器公司提供的表面增強(qiáng)試劑及配套助劑一般受專利保護(hù),使用成本相對(duì)較高;本文采用自制表面增強(qiáng)試劑(納米金)與簡(jiǎn)智公司提供的表面增強(qiáng)試劑對(duì)比研究增強(qiáng)效果,并進(jìn)一步比較兩者對(duì)保健品中西地那非的陽(yáng)性檢出率;擬將自行研制的表面增強(qiáng)試劑(納米金)推廣于公安食藥環(huán)偵部門(mén)快檢實(shí)驗(yàn)室,為食藥案件的主動(dòng)破獲提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西地那非 批號(hào)510068-201401,中國(guó)食品藥品檢定研究院;21種保健品 來(lái)源于某市公安局食藥環(huán)偵部門(mén)查繳,如表4所示;表面增強(qiáng)劑 簡(jiǎn)智公司提供的表面增強(qiáng)試劑及實(shí)驗(yàn)室自制納米金;簡(jiǎn)智公司提供的助劑B6;鹽酸、硝酸、硫酸、氯金酸和檸檬酸鈉(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙腈(HPLC色譜試劑) 德國(guó)默克(MERCK)公司。

SSR-3000便攜式拉曼光譜儀 簡(jiǎn)智儀器公司;ME104電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Tripe QTOF 5600+超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用 美國(guó)AB公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 西地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取西地那非標(biāo)準(zhǔn)品,甲醇定容至1 mg·mL-1,作為儲(chǔ)備液Ⅰ,于4 ℃避光貯存,臨用時(shí)稀釋備用。

1.2.2 保健品中西地那非的提取 稱取保健品0.1 g,甲醇定容至10 mL,5000 r/min離心5 min,取上清液稀釋100倍作為儲(chǔ)備液Ⅱ,冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 納米金表面增強(qiáng)劑的制備 采用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法[23]制備膠體金溶液。分別移取一定體積(0.95、1、1.1、1.15、1.2 mL)濃度為1%的氯金酸至裝有100 mL超純水和磁石的燒杯里,將燒杯放置于磁石加熱攪拌器上,進(jìn)行恒溫加熱至沸騰之后,迅速打開(kāi)磁力攪拌器,逐滴加入濃度為1%檸檬酸鈉水溶液1 mL,使其充分反應(yīng);反應(yīng)過(guò)程中,溶液顏色變化過(guò)程為無(wú)色透明-黑色-紫-藍(lán)-酒紅色透明狀。繼續(xù)進(jìn)行加熱攪拌至6 min,停止加熱以及攪拌,冷卻至室溫,然后將其放置棕色瓶中避光保存,逐次命名為A1、A2、A3、A4、A5。

1.2.4 助劑的制備

1.2.4.1 助劑B的制備 配制摩爾體積濃度分別為1.71、2、2.4、3 mol·L-1的鹽酸溶液,逐次命名為助劑B1、B2、B3、B4。

1.2.4.2 助劑C的制備 配制摩爾體積濃度分別為2.28、2.67、3.2、4 mol·L-1的硝酸溶液,逐次命名為助劑C1、C2、C3、C4。

1.2.4.3 助劑D的制備 配制摩爾體積濃度為5.14 mol·L-1的硫酸溶液,命名為助劑D。

1.2.5 西地那非拉曼光譜分析

1.2.5.1 拉曼光譜條件 檢測(cè)步驟為:激光波長(zhǎng)為785 nm,功率為275 MW,掃描范圍為175～3200 cm-1,分辨率為4.5 cm-1。

1.2.5.2 拉曼光譜分析 取100 μL儲(chǔ)備液樣品(或稀釋至一定濃度的西地那非標(biāo)樣),先加入200 μL表面增強(qiáng)試劑,再加入20 μL助劑用以調(diào)節(jié)體系酸堿,混合均勻后開(kāi)始拉曼光譜測(cè)試,譜圖采集時(shí)間為10 s。

1.2.6 西地那非液質(zhì)聯(lián)用儀分析

1.2.6.1 液相色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm,1.8 μm);流動(dòng)相:A:5 mmol·L-1醋酸銨-0.1%甲酸緩沖溶液 B:乙腈。梯度洗脫程序如表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.6.2 質(zhì)譜條件 電離方式:電噴霧正(負(fù))離子模式。離子源參數(shù):霧化氣壓力(GS1)50 psi,輔助加熱氣(GS2):50 psi,氣簾氣(CUR):35 psi,干燥氣溫度:500 ℃,離子化電壓:正離子模式5500 V;一級(jí)質(zhì)譜條件:去簇電壓(DP):80 V,碰撞能量(CE):10 V。二級(jí)質(zhì)譜條件:碰撞能量(CE):50 V;碰撞能量范圍(CES):15～20 V。

1.2.6.3 液質(zhì)聯(lián)用儀分析 儲(chǔ)備液Ⅰ稀釋至100 ng·mL-1進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用儀分析;儲(chǔ)備液Ⅱ稀釋100倍后,微孔濾膜過(guò)濾(0.22 μm,有機(jī)相)進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西地那非標(biāo)樣的SERS分析

2.1.1 不同表面增強(qiáng)試劑對(duì)西地那非標(biāo)樣SERS分析 采用廠家表面增強(qiáng)試劑、實(shí)驗(yàn)室自制納米金A1、A2、A3、A4及A5,對(duì)濃度為0.02 μg·mL-1的西地那非標(biāo)品進(jìn)行表面增強(qiáng)分析,結(jié)果表明,自制的納米金A2、A3及廠家提供的增強(qiáng)試劑檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,納米金A2及廠家提供的增強(qiáng)試劑譜圖信息基本一致,如圖1～圖2所示,在645.9、1526.2、1578.0 cm-1等波數(shù)處出現(xiàn)強(qiáng)度較強(qiáng)的西地那非類特征峰[21];納米金A3譜圖信息不及納米金A2譜圖信息豐富,且強(qiáng)度弱于A2;自制的納米金A1、A4、A5檢測(cè)結(jié)果為陰性。因而,可以認(rèn)為自制納米金A2與廠家提供表面增強(qiáng)試劑功效接近,較有利于那非類成分的檢測(cè)。

圖1 廠家表面增強(qiáng)試劑的SERS譜圖

圖2 納米金A2的SERS譜圖

2.1.2 西地那非標(biāo)樣陽(yáng)性檢出限的考察 廠家提供表面增強(qiáng)試劑和助劑B6可對(duì)0.01 μg·mL-1西地那非陽(yáng)性檢出;以自制納米金A2結(jié)合助劑B、C、D對(duì)0.01 μg·mL-1西地那非標(biāo)樣進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如表2所示。從表2可知,只有助劑C2對(duì)0.01 μg·mL-1西地那非標(biāo)樣陽(yáng)性檢出。進(jìn)一步以自制納米金A2結(jié)合助劑C2對(duì)2、0.02、0.01 μg·mL-1西地那非標(biāo)樣進(jìn)行表面增強(qiáng)檢測(cè),1397.8、1526.2以及1580.2 cm-1等特征峰[21]峰強(qiáng)度列舉在表3中,三者的檢驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性。從表3可以看出,隨著濃度的不斷降低,西地那非類特征峰的強(qiáng)度在不斷減弱,在0.01 μg·mL-1的條件下,SERS譜圖出現(xiàn)的特征峰強(qiáng)度較弱,并且有些特征峰開(kāi)始消失,由此可認(rèn)為,自制納米金A2結(jié)合助劑C2表面增強(qiáng)后對(duì)0.01 μg·mL-1西地那非陽(yáng)性檢出已接近檢出限。

表2 納米金A2、不同助劑對(duì)0.01 μg·mL-1 西地那非標(biāo)樣表面增強(qiáng)效果影響

表3 自制納米金A2表面增強(qiáng)不同濃度的西地那非標(biāo)樣相關(guān)特征峰峰強(qiáng)度

2.2 21種抗疲勞保健品樣品的SERS檢測(cè)和液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 21種保健品樣品液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)結(jié)果 100 ng·mL-1西地那非標(biāo)樣液質(zhì)聯(lián)用儀分析提取離子流圖和質(zhì)譜圖如圖3和圖4所示。從圖3和圖4可知,西地那非保留時(shí)間為8.59 min,母離子m/z為475,主要碎片離子為 m/z 311、283;21種保健品共22個(gè)樣品有21種西地那非陽(yáng)性檢出,如表4第4欄所示。

圖3 西地那非提取離子流圖

圖4 西地那非的質(zhì)譜圖

表4 廠家提供表面增強(qiáng)劑及助劑B6與實(shí)驗(yàn)室自制納米金A2及助劑C2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 21種保健品樣品SERS檢測(cè)的結(jié)果 分別使用廠家提供的表面增強(qiáng)試劑和助劑B6及實(shí)驗(yàn)室自制納米金A2和助劑C2對(duì)22個(gè)樣品進(jìn)行SERS檢測(cè)。廠家提供的表面增強(qiáng)試劑檢測(cè)結(jié)果記為檢測(cè)結(jié)果A,自制納米金A2以及助劑C2的檢測(cè)結(jié)果記為檢測(cè)結(jié)果B,分別如表4第5、6欄和7、8欄所示。表4中匹配度是儀器對(duì)分析圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜自動(dòng)比對(duì)時(shí)提供的分析結(jié)果,匹配度越高,說(shuō)明陽(yáng)性結(jié)果的可靠性越高。

從表4可以看出,檢測(cè)結(jié)果A中2-1號(hào)、4號(hào)、6號(hào)樣與液質(zhì)聯(lián)用儀不一致,吻合度為86.4%;檢測(cè)結(jié)果B與保健品的液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)結(jié)果完全一致,吻合度為100%。

2.3 保健品中西地那非的SERS分析條件考察

考慮保健品基質(zhì)效應(yīng)對(duì)表面增強(qiáng)效果的影響,以表4中陽(yáng)性檢出,但匹配度為50%的1號(hào)、6號(hào)和21號(hào)樣品為例對(duì)表面增強(qiáng)條件進(jìn)行考察。

2.3.1 不同納米金對(duì)保健品中西地那非陽(yáng)性檢驗(yàn)效果比對(duì) 同用助劑C2,分別運(yùn)用A2、A3及A5納米金對(duì)1號(hào)、6號(hào)和21號(hào)樣品進(jìn)行SERS檢測(cè),結(jié)果如表5所示,其中陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的表面增強(qiáng)圖譜如圖5～圖9所示。

表5 不同納米金對(duì)1號(hào)、6號(hào)、21號(hào)樣品表面增強(qiáng)效果影響

圖5 納米金A21號(hào)樣品的SERS譜圖

圖6 納米金A3測(cè)定1號(hào)樣品的SERS譜圖

圖7 納米金A5測(cè)定1號(hào)樣品的SERS譜圖

圖8 納米金A2測(cè)定6號(hào)樣品的SERS譜圖

圖9 助劑C2測(cè)定21號(hào)樣品的SERS譜圖

由表5可知,6號(hào)和21號(hào)樣品納米金A3和A5檢測(cè)結(jié)果為陰性,其余的都是西地那非陽(yáng)性檢出;圖5～圖8及圖15中西地那非特征峰出峰明顯,納米金A2更能有效檢測(cè)出保健品中那非類成分;與文中2.1.1所得結(jié)論一致,保健品基質(zhì)對(duì)表面增強(qiáng)影響不大。

2.3.2 不同助劑對(duì)部分保健品中西地那非陽(yáng)性檢驗(yàn)效果比對(duì) 同用納米金A2,比較廠家助劑B6、助劑B(B1、B2、B3、B4)、助劑C(C1、C2、C3、C4)以及助劑D對(duì)1號(hào)、6號(hào)和21號(hào)檢測(cè)效果的影響;表6列舉了陽(yáng)性檢出結(jié)果,表面增強(qiáng)圖譜如圖10～圖15所示。分別比較圖10、圖11、圖12,圖13、圖14和圖9、圖15,助劑C2的特征峰增強(qiáng)效果更明顯。因而,可以認(rèn)為助劑C2更能有效檢測(cè)出保健品中那非類成分,與文中2.1.2所得結(jié)論一致,說(shuō)明保健品基質(zhì)影響不大。

表6 納米金A2、不同助劑對(duì)1、6、21號(hào)樣品表面增強(qiáng)效果影響

圖10 助劑C2測(cè)定1號(hào)樣品的SERS譜圖

圖11 助劑B2測(cè)定1號(hào)樣品的SERS譜圖

圖12 助劑D測(cè)定1號(hào)樣品的SERS譜圖

圖13 廠家助劑B6測(cè)定6號(hào)樣品的SERS譜圖

圖14 助劑C2測(cè)定6號(hào)樣品的SERS譜圖

圖15 助劑B2測(cè)定21號(hào)樣品的SERS譜圖

3 結(jié)論

本文運(yùn)用便攜式拉曼光譜(SERS)技術(shù)、自制納米金表面增強(qiáng)試劑對(duì)西地那非標(biāo)樣及保健品中西地那非進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,自制納米金表面增強(qiáng)試劑可對(duì)濃度為0.01 μg·mL-1西地那非陽(yáng)性檢出,21種保健品中西地那非的檢出效果稍強(qiáng)于廠家提供的增強(qiáng)試劑檢測(cè)效果,與飛行時(shí)間-液質(zhì)聯(lián)用儀(QTOF-LC-MS)分析結(jié)果一致。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果為SERS技術(shù)在抗疲勞類保健品中的那非類快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供可行性方案,為公安食藥環(huán)偵部門(mén)主動(dòng)發(fā)現(xiàn)線索提供技術(shù)保障。初步認(rèn)為自制納米金A2結(jié)合助劑C2表面增強(qiáng)效果不差于廠家提供的表面增強(qiáng)試劑,應(yīng)能滿足保健品中西地那非的檢測(cè)。