高效液相色譜法測定食品中丙酸及其鹽類

盧蘭香,孫珊珊,薛 霞,別 梅,尹麗麗,王 駿,祝建華,劉艷明

(山東省食品藥品檢驗研究院,山東濟南 250101)

丙酸及其鹽類是世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)批準使用的安全可靠的食品防霉劑,可有效抑制食品中霉菌、芽孢桿菌及革蘭氏陰性菌等生長繁殖,也可以抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生[1]。丙酸及其鹽類的安全性和防腐效果優(yōu)于苯甲酸,價格低于山梨酸,是理想的食品防腐劑之一[2]。食品中存在的丙酸鹽主要為丙酸鈉或丙酸鈣,GB2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》對不同食品中丙酸及其鈉鹽、鈣鹽的最大使用量做出了規(guī)定[3]。由于人體長期過量攝入含丙酸及其鹽類的食品會導致嘔吐、腹痛和肺水腫等[4],所以針對食品中的丙酸及其鹽類的安全監(jiān)管,建立快速、簡單、準確的分析方法十分必要。

目前,測定丙酸及其鹽類的方法有氣相色譜法[5-6]、氣相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]、高效液相色譜法[9-10]、離子色譜法[11-12]。相比氣相色譜法和離子色譜法,液相色譜法更簡單,易操作,方法準確度更好,儀器普及率高。已報道的食品中丙酸的前處理方法主要包括直接浸提法定[10,13]、水蒸汽蒸餾法[5,13]、有機溶劑萃取法[6,8-9],但沉淀劑法尚未見報道。GB 5009.120-2016《食品中丙酸鈉、丙酸鈣的測定》[13]水蒸氣蒸餾法步驟繁瑣、耗時,不利于大批量樣品的分析檢測;直接浸提法回收率高但樣品干擾較大,而沉淀劑法[14-16]具有前處理簡單、快速、試劑成本低等優(yōu)點,常被用于食品檢測的前處理;所以實驗擬將沉淀劑用于食品中丙酸及其鹽類的檢測。

本文采用高效液相色譜法,系統(tǒng)考察了沉淀劑種類、沉淀劑用量、不同提取條件、不同提取方法對不同食品中丙酸提取和分離的影響,并考察了緩沖鹽種類、濃度和pH以及色譜柱種類對分離的影響,以期建立食品中丙酸及其鹽類的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丙酸標準品 德國Dr. Ehrenstorfer公司;磷酸氫二胺(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;磷酸(優(yōu)級純) 國藥集團化學試劑有限公司;乙酸鋅(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;亞鐵氰化鉀(分析純) 天津市科密歐化學試劑有限公司;pH0.5～5.0精密試紙 中國上海三愛思試劑有限公司;實驗用的面包、糕點、鮮面條、腐竹、豆腐、豆?jié){、小麥、楊梅罐頭 均購自于當?shù)爻小?/p>

Waters 2695高效液相色譜儀(配備Waters 2998二極管陣列檢測器) 美國Waters公司;AB204-S型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;SB-800DTD型超聲波清洗器 中國寧波新芝生物科技股份有限公司;Sigma 3-18K型冷凍離心機 德國Sigma公司;Milli-Q超純水制備器 美國Millipore公司;MS3渦旋混合器 德國IKA公司;GM-300型粉碎機 德國萊馳公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準儲備溶液的配制 丙酸標準儲備溶液(1.0 mg/mL)的配制:準確稱取丙酸標準品25 mg于25 mL容量瓶中,用水溶解并定容至刻度線,充分搖勻備用。此溶液于4 ℃條件下保存。

1.2.2 樣品前處理 稱取2.5 g樣品(面包、糕點、鮮面條、腐竹、豆腐、豆?jié){、小麥、楊梅罐頭)于25 mL比色管中,加入10 mL水,漩渦混合2 min,用1 mol/L磷酸溶液調(diào)pH為2.5～3.0,超聲提取20 min。冷卻至室溫后加亞鐵氰化鉀溶液(92 g/L)1 mL和乙酸鋅溶液(183 g/L)1 mL,混勻,用水定容至25.00 mL,8000 r/min離心5 min。經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾后,待液相色譜測定。

1.2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

1.2.3.1 沉淀劑種類的選擇 參考文獻[14-16]對食品中常用的三種沉淀劑氫氧化鈉-硫酸鋅、亞鐵氰化鉀-乙酸鋅、5%三氯乙酸水溶液進行了考察,并考察了亞鐵氰化鉀-乙酸鋅和氫氧化鈉-硫酸鋅兩種沉淀劑對面包、腐竹、鮮面條、小麥、楊梅罐頭等不同樣品的回收率和精密度的影響,其中丙酸添加濃度為0.25 g/kg。

1.2.3.2 沉淀劑用量的選擇 實驗以面包陽性樣品為例,考察了加入亞鐵氰化鉀溶液-乙酸鋅溶液(體積比1∶1)總體積為1、2、3、4 和5 mL對沉淀效果和提取的影響。

1.2.4 提取條件的選擇

1.2.4.1 酸化對丙酸提取效率的影響 為了驗證不同提取條件對丙酸及其鹽類提取的影響,實驗分別考察了加水后用1 mol/L磷酸溶液調(diào)pH為2.5～3.0酸化和不酸化,對面包、腐竹、鮮面條、小麥、楊梅罐頭等陰性樣品回收率的影響,丙酸添加濃度為1.0 g/kg;對面包和糕點陽性樣品中丙酸及其鹽類提取的影響。

1.2.4.2 酸化對丙酸分離的影響 由于樣品提取液的酸度有可能影響目標物的分離,所以實驗采用面包、糕點、豆?jié){、豆腐、腐竹、鮮面條、小麥、楊梅罐頭樣品,考察了在用高效液相色譜分析檢測時，1 mol/L磷酸溶液調(diào)pH為2.5～3.0酸化和不酸化對丙酸分離的影響。

1.2.4.3 提取方式的比較 為了驗證本方法的可行性,實驗考察了不同提取方式對樣品中丙酸回收率和樣品凈化效果的影響。選取面包和糕點陰性樣品采用本方法和直接浸提法[13];選取腐竹和鮮面條陰性樣品,采用本方法和水蒸氣蒸餾法[13],分別考察了不同提取方式對丙酸回收率的影響,其中丙酸添加濃度為0.5 g/kg。

1.2.5 高效液相色譜條件 色譜柱:Atlantis T3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:(NH4)2HPO4(10 mmol/L,pH3.0);流速1.0 mL/min;進樣體積50 μL;柱溫35 ℃;檢測波長214 nm。

1.2.6 色譜條件的優(yōu)化

1.2.6.1 色譜柱的選擇 實驗比較了Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Xbridge C18色譜(4.6 mm×250 mm,5 μm)和Atlantis T3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)三種色譜柱對分離效果的影響。

1.2.6.2 流動相種類的選擇 實驗采用面包陽性樣品,考察了在pH3.0條件下磷酸水溶液、K2HPO4、(NH4)2HPO4對丙酸分離效果的影響。

1.2.6.3 流動相濃度的選擇 實驗采用面包陽性樣品,按照1.2.2對樣品進行前處理,將流動相分別配成濃度為5、10、20 mmol/L的(NH4)2HPO4溶液(pH3.0),比較了丙酸的分離情況。

1.2.6.4 流動相pH的選擇 實驗采用面包陽性樣品,按照1.2.2對樣品進行前處理,考察了pH2.0、2.5、3.0、3.5、4.0對丙酸及其雜質(zhì)分離效果的影響。

1.2.6.5 檢測波長的選擇 取配制好的丙酸標準溶液(559.5 μg/mL),用光電二極管陣列紫外可見光檢測器于190～400 nm的波長范圍內(nèi)進行紫外光全波長掃描。

1.2.7 方法學考察

1.2.7.1 線性范圍、檢出限、定量限 將1.2.1標準儲備溶液用水逐級稀釋成5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、100.0、200.0、300.0、400.0、500.0 μg/mL的標準工作溶液,按濃度從低到高的順序,按1.2.5高效液相色譜條件進行測定,以丙酸峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X)作標準曲線。采用空白基質(zhì)加標的方法,以信噪比S/N=10得到目標物的定量限(LOQ),以信噪比S/N=3得到目標物的檢出限(LOD)。

1.2.7.2 回收率和精密度實驗 實驗采取分別向空白樣品中添加2個濃度水平的標準溶液,面包、糕點、腐竹、豆腐、豆?jié){、鮮面條、小麥、楊梅罐頭中添加0.10和1.5 g/kg,鮮面條中添加0.10和0.25 g/kg,每個濃度水平平行測定6次,計算方法的回收率及精密度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過與儀器配套的Empower 3色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)采集與處理,以及Origin 8.0進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 沉淀劑的選擇

2.1.1.1 沉淀劑種類的選擇 結(jié)果顯示(表1):加入5%三氯乙酸水溶液后,面包、腐竹、鮮面條、小麥、楊梅罐頭等樣品處理液渾濁,離心后濾液仍然很渾濁，無法通過微孔濾膜進樣測定。亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀劑與氫氧化鈉-硫酸鋅相比,能更好地去除樣品中的蛋白質(zhì)和脂肪,離心后樣品濾液更澄清,更易通過微孔濾膜;且亞鐵氰化鉀-乙酸鋅和氫氧化鈉-硫酸鋅沉淀劑對于樣品的回收率(表1)分別為85.1%～109.4%(RSD≤3.78%)和82.3%～112.5%(RSD≤3.89%),二者差異很小。實驗選擇亞鐵氰化鉀-乙酸鋅作為沉淀劑。

表1 不同沉淀劑的回收率和精密度(n=6)

2.1.1.2 沉淀劑用量的選擇 研究表明(圖1):隨著沉淀劑體積的增加,檢測結(jié)果變化很小。但是加入1 mL時,處理液產(chǎn)生輕度沉淀,樣品濾液渾濁,無法通過微孔濾膜;加入2、3、4和5 mL時,處理液均產(chǎn)生明顯沉淀,上層液清晰,濾液均可順利通過濾膜。所以實驗選用亞鐵氰化鉀溶液-乙酸鋅溶液總體積為2 mL。

圖1 沉淀劑總體積對丙酸及其鹽類提取的影響

2.1.2 提取條件的選擇

2.1.2.1 酸化對丙酸提取效率的影響 實驗表明(圖2),對于面包、腐竹、鮮面條、小麥、楊梅罐頭等陰性樣品回收率均不存在明顯差異,可能是由于加入的丙酸為游離狀態(tài),酸化和不酸化均不影響丙酸的提取,所以二者回收率基本無差異。

圖2 酸化和不酸化對陰性樣品丙酸及其鹽類回收率的影響

為了進一步驗證酸化對于丙酸及其鹽類提取的影響,實驗采用面包和糕點陽性樣品作為考察對象,結(jié)果見圖3。

圖3 酸化和不酸化對陽性樣品丙酸及其鹽類提取的影響

由圖3可見,酸化和不酸化對于糕點和面包陽性樣品的提取效率沒有明顯差異。

原因可能是食品中存在的丙酸鹽主要為丙酸鈉或丙酸鈣,二者均溶于水;酸化時以丙酸分子形式存在,不酸化時以丙酸根離子形式存在,用高效液相色譜分析檢測時,在(NH4)2HPO4溶液(pH3.0)的最優(yōu)流動相條件下轉(zhuǎn)化為丙酸分子的形式,所以酸化和不酸化都不影響丙酸及其鹽類的提取。

2.1.2.2 酸化對丙酸分離的影響 實驗發(fā)現(xiàn):不酸化時,對于面包、糕點、豆?jié){、豆腐、腐竹、鮮面條、小麥、楊梅罐頭多數(shù)樣品,丙酸保留時間比較穩(wěn)定;但面包和糕點個別樣品會出現(xiàn)0.2～0.3 min的漂移。原因可能是當樣品提取液酸度與流動相酸度相近時,樣品中丙酸保留時間與丙酸標準溶液保留時間一致;當樣品提取液酸度與流動相相差較大時,會造成樣品溶液與流動相不匹配,導致保留時間出現(xiàn)輕微漂移。

綜上,實驗提取時選擇用1 mol/L磷酸溶液調(diào)pH為2.5～3.0酸化。

2.1.3 提取方式的比較 由表2可見,本方法與直接浸提法相比,回收率差異很小;但明顯高于水蒸氣蒸餾法。原因可能是本方法和直接浸提法前處理都比較簡單,丙酸在提取過程中損失比較少,所以二者回收率無明顯差異。而水蒸氣蒸餾法,一方面由于裝置復雜,連接處較多,密封性難以保證;另一方面由于裝置的局限性致使部分含目標物的蒸汽未到達接收裝置之前即被外界冷卻而回流,難以蒸餾出來,導致回收率偏低。

表2 不同方法的回收率和精密度(n=6)

由于提取方式也會影響樣品的凈化效果,而本方法和直接浸提法對丙酸提取的影響差異很小,所以實驗進一步考察了二者對樣品的凈化效果的影響,結(jié)果見圖4。由圖4可見,直接浸提法色譜圖中雜峰明顯多于本方法。而且直接浸提法樣品處理液粘稠、溶液渾濁,濾液難以通過微孔濾膜。所以直接提取法凈化效果不理想。

圖4 不同提取方法對丙酸及其鹽類凈化效果的影響

以上實驗結(jié)果表明,本方法對于丙酸的提取效果優(yōu)于水蒸氣蒸餾法,凈化效果優(yōu)于直接提取法。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 結(jié)果表明(圖5):Atlantis T3 C18色譜柱對丙酸有較好的保留(tR=17.895 min),在選定的條件下可完全分離目標物與雜質(zhì),實現(xiàn)準確定性和定量;但Symmetry C18和Xbridge C18,對丙酸的保留時間分別為10.218 min、11.493 min,保留較弱,均不能實現(xiàn)目標物與雜質(zhì)的有效分離。原因可能是丙酸為強極性化合物,在Symmetry C18和Xbridge C18色譜柱上不易被保留,但是Atlantis T3 C18色譜柱采用3個Si-C鍵將一個C18鏈鍵合到硅膠表面,具有很好的低pH穩(wěn)定性,100%水相流動相兼容,而且由于空間位阻的作用,導致C18表面鍵合密度低,從而增加了對極性化合物的保留,特別適合極性化合物的分析。所以,實驗最終選擇Atlantis T3 C18色譜柱。

圖5 不同色譜柱對丙酸及其鹽類分離的影響

2.2.2 流動相條件的選擇

2.2.2.1 流動相種類的選擇 因為丙酸的檢測波長較低,有些緩沖鹽溶液在波長210 nm附近有較強的吸收[17],干擾測定。而磷酸鹽緩沖溶液在紫外區(qū)幾乎無吸收,所以可作為丙酸測定的流動相。研究表明,用磷酸水溶液時(圖6A),樣品溶液紫外光譜圖在262 nm處也有較大吸收峰,與丙酸標準溶液光譜圖不相符,說明丙酸與雜質(zhì)不能有效分離。用(NH4)2HPO4和K2HPO4溶液作流動相時,均不會存在圖6A的現(xiàn)象,但是(NH4)2HPO4峰形優(yōu)于K2HPO4(圖6B),所以實驗選擇(NH4)2HPO4。

圖6 不同緩沖鹽對丙酸及其鹽類分離的影響

2.2.2.2 流動相濃度的選擇 由圖7可見:濃度為5 mmol/L時,丙酸色譜峰的對稱因子為0.80,峰前伸;10 mmol/L和20 mmol/L時,色譜峰的對稱因子分別為1.01、1.04,峰形較好。但高濃度的鹽會對色譜儀的輸液泵和色譜柱的壽命產(chǎn)生影響,所以本實驗選擇(NH4)2HPO4的最佳濃度為10 mmol/L。

圖7 緩沖鹽濃度對丙酸及其鹽類分離的影響

2.2.2.3 流動相pH的選擇 由于丙酸為有機酸極性較大,在水溶液中易解離而不被非極性鍵合相保留,因此一般使用酸性流動相來抑制有機酸的解離[18-19],使有機酸盡可能以分子形式存在,以改善待測物的保留和分離。結(jié)果表明(圖8):當pH為3.5時,峰形很寬;而pH4.0時,丙酸與雜質(zhì)分不開;而pH2.0～3.0時保留時間變化很小,分離效果都比較好,從保護色譜柱的角度考慮,本實驗選擇流動相pH為3.0。

圖8 緩沖鹽酸度對丙酸及其鹽類分離的影響

綜上所述,實驗選擇10 mmol/L、pH3.0的(NH4)2HPO4溶液為流動相。

2.2.3 檢測波長的選擇 從圖9丙酸的全波長掃描圖可以看出,丙酸的最大吸收波長為214 nm,故選擇214 nm作為檢測波長。

圖9 丙酸的全波長掃描圖

2.3 方法學評價

實驗采用空白樣品,按1.2.2樣品前處理過程和1.2.5高效液相色譜條件,對方法學進行評價。

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限 丙酸在5.0～500.0 μg/mL之間線性關(guān)系良好,線性回歸方程為:Y=1400X-544,R2大于0.999,LOD為0.02 g/kg,LOQ為0.05 g/kg。圖10 為丙酸標準溶液(223.8 μg/mL)、面包空白樣及加標水平為0.5 g/kg的液相色譜圖。

圖10 實際樣與加標樣及丙酸標準溶液的液相色譜圖

2.3.2 回收率和精密度 由表3可見,樣品加標回收率為85.1%～109.4%,相對標準偏差為0.51%～3.78%。說明方法的數(shù)據(jù)穩(wěn)定,精密度良好。

表3 方法的回收率和精密度(n=6)

2.4 實際樣品的測定

應用本方法對市售的面包(10份)、糕點(10份)、豆制品(6份)、生濕面制品(4份)、原糧(3份)、其他(楊梅罐頭加工工藝)(2份)進行分析。檢測結(jié)果顯示:6份面包檢出,含量為0.104～1.170 g/kg,3份糕點檢出,含量為0.229～0.248 g/kg,其余樣品均未檢出;所以所檢樣品中丙酸含量均低于GB 2760-2014中規(guī)定的限量要求(面包、糕點、豆類制品最大使用量均為2.5 g/kg,生濕面制品為0.25 g/kg,原糧1.8 g/kg,其他(楊梅罐頭加工工藝)為50 g/kg)。

3 結(jié)論

系統(tǒng)考察了不同沉淀劑、不同沉淀劑用量、不同提取條件、不同提取方法對丙酸提取和分離的影響,并優(yōu)化了色譜條件,建立了高效液相色譜法測定食品中丙酸及其鹽類的分析方法。本方法用水提取食品中的丙酸及其鹽類,采用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀劑沉淀蛋白和雜質(zhì),使試樣前處理簡單、快捷、試劑成本低;Atlantis T3 C18 色譜柱對丙酸具有較好的保留,在選定的磷酸氫二氨(10 mmol/L,pH3.0)溶液為流動相條件下,可實現(xiàn)目標物與雜質(zhì)的完全分離、準確定性和定量。丙酸在5.0～500.0 μg/mL之間線性關(guān)系良好,平均回收率為85.1%～109.4%,方法定量限為0.05 g/kg。該方法簡單易行,結(jié)果穩(wěn)定、可靠、準確;適用于批量食品樣品中丙酸的測定,為企業(yè)和檢驗機構(gòu)提供了技術(shù)支持,提高了檢驗工作的工作效率。