響應面法優(yōu)化機械砂磨輔助提取婆棗中原花青素工藝

程海濤,申獻雙

(1.衡水學院化工學院,河北衡水 053000;2.衡水學院美術(shù)學院,河北衡水 053000)

婆棗是產(chǎn)于河北地區(qū)的一種大棗,其適種性強,果實形狀為長圓或倒雞蛋圓形,大小齊整,果肉以青白顏色為主,口感脆而甜,汁多、果皮微薄、柔韌性差,成熟果實呈深棕紅色。婆棗含有多種營養(yǎng)物質(zhì)和天然成分,是營養(yǎng)與食療保健的進補佳品,同時是一種具有益氣填中、安神補血、調(diào)和藥用的中藥材[1]。

原花青素是一種抗氧化性極強的多酚類化合物,屬于天然抗氧化劑,提取方法有溶劑浸提法、超聲波輔助法、微波輔助提取法、超臨界萃取法、生物輔助提取法等。劉瓊等[2]利用超聲波提取雞蛋棗中的原花青素,利用單因素、響應面試驗優(yōu)化了提取工藝,提取率為1.82%,抗氧化實驗證明性能優(yōu)于VC。張娜等[3]通過傳統(tǒng)蒸制方式,研究了蒸制時間對原花青素的影響趨勢,利用高效液相測定其含量,結(jié)果表明高溫會降低原花青素提取率。樊永紅等[4]利用70%乙醇溶液作為提取劑,提取了新疆沙棗中的原花青素,利用正交試驗優(yōu)化了工藝,提取率達2.9 mg/g。徐亞維等[5]以山東小棗為研究對象,利用70%乙醇為提取劑,采用二次提取工藝提取了山東小棗中的原花青素,提取率接近1.89%。除此之外,研究人員利用溶劑浸提、超聲波輔助、常壓蒸餾等方法對山東小棗、駿棗、冬棗中天然成分原花青素等的含量、抗氧化清除自由基性能進行了相關(guān)研究報道[6-15]。但是利用機械砂磨強化河北深州婆棗中原花青素的提取工藝的研究未見發(fā)表,尤其是把機械砂磨引入天然成分提取尚屬首次。

機械砂磨是一種利用研磨介質(zhì)相互摩擦、碰撞,產(chǎn)生相應機械剪切力,減小物質(zhì)粒徑,破壞組織的物理性方法。機械砂磨具有對環(huán)境無影響、不產(chǎn)生污染物、破壁效率高、對有效物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)保護性高、能量消耗低等特點,對天然物質(zhì)的破壁提取有一定的強化作用。

本研究首次利用機械砂磨技術(shù),以深州婆棗為研究對象,利用響應面實驗設計優(yōu)化機械砂磨輔助提取深州婆棗中原花青素工藝,為深州婆棗在食品、化妝品等領(lǐng)域的綜合利用提供堅實的理論基礎(chǔ)和詳實的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

婆棗 河北深州;甲醇、硫酸、無水乙醇 分析純,西隴科學股份有限公司;香草醛 分析純,天津市大茂化學試劑廠;原花青素標準品 純度 99.9%,西隴科學股份有限公司。

SFJ-400砂磨、分散、攪拌(550 W)機 上?，F(xiàn)代環(huán)境工程技術(shù)有限公司;研磨玻璃珠(2～5 mm) 衡水瑞豐化玻儀器有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化公司;T6新型紫外-可見分光光度計 寧波歐普儀器有限公司;HH-S4型恒溫水浴鍋 北京市長風儀器儀表公司;TP-A100型電子天平 金壇市國旺實驗儀器廠;AR1140型離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 深州婆棗中原花青素的提取工藝 新鮮深州婆棗切成塊狀,在溫度為70 ℃烘箱里烘干至恒重[16],粉碎過35目篩子,待用。按照一定液料比配制婆棗顆粒-乙醇溶液1 L,加入一定體積研磨材料(2 mm玻璃珠),研磨一定時間,將溶液用200目篩網(wǎng)過濾,然后用定量濾紙過濾,最后經(jīng)過離心機離心,將制備好的婆棗原花青素溶液進行原花青素含量測定。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 研磨時間對原花青素得率的影響 為了探究研磨時間與原花青素得率之間的關(guān)系,在研磨材料(玻璃珠)粒徑2 mm,研料用量20%,研磨溫度50 ℃,液料比20 mL/g,乙醇體積分數(shù)50%條件下進行試驗,研究不同研磨時間5、10、15、20、25 min對原花青素得率的影響。

1.2.2.2 研磨材料粒徑對原花青素得率的影響 在研磨時間15 min,研料用量20%,研磨溫度50 ℃,液料比20 mL/g,乙醇體積分數(shù)50%條件下進行試驗,探討研磨材料1、2、3、4、5 mm粒徑對原花青素得率的影響。

1.2.2.3 研料用量對原花青素得率的影響 在研磨時間15 min,研磨材料粒徑3 mm,研料用量20%,研磨溫度50 ℃,液料比20 mL/g,乙醇體積分數(shù)50%條件下進行試驗,探討研料用量分別為10%、20%、30%、40%、50%條件下對原花青素得率的影響。

1.2.2.4 研磨溫度對原花青素得率的影響 在研磨時間15 min,研磨材料粒徑3 mm,研料用量30%,液料比20 mL/g,乙醇體積分數(shù)50%條件下進行試驗,探討研磨溫度分別為40、50、60、70、80 ℃對原花青素得率的影響。

1.2.2.5 液料比對原花青素得率的影響 在研磨時間15 min,研磨材料粒徑3 mm,研料用量30%,研磨溫度60 ℃,乙醇體積分數(shù)50%條件下進行試驗,探討液料比分別為15、20、25、30、35 mL/g對原花青素得率的影響。

1.2.2.6 乙醇體積分數(shù)對原花青素得率的影響 在研磨時間15 min,研磨材料粒徑3 mm,研料用量30%,研磨溫度60 ℃,液料比25 mL/g條件下進行試驗,探討乙醇體積分數(shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%對原花青素得率的影響。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取婆棗原花青素得率為響應值Y(%),影響因素研磨粒徑(直徑)(X1),研磨時間(X2),乙醇體積分數(shù)(X3),研磨溫度(X4)進行響應面實驗設計,優(yōu)化因素水平。響應面優(yōu)化試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平

1.2.4 原花青素含量的測定以及得率的計算

1.2.4.1 標準曲線的確定 稱量原花青素標準品0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1 g,用分析純甲醇試劑溶解于容量瓶中,定容至100 mL。根據(jù)香草醛-鹽酸法[19]測量500 nm溶液處吸光度,繪制濃度-吸光度標準品曲線,經(jīng)過回歸擬合得到標準方程為:y=0.4514x-0.0356,R2=0.9996。

1.2.4.2 原花青素得率的計算 首先利用原花青素回歸擬合標準曲線測定樣品中原花青素濃度,具體方法如下:利用吸量管取1 mL提取液,放置于20 mL燒杯中,同時加入1%香草醛-甲醇與30%濃鹽酸-甲醇溶液,體積分別為5 mL,在30 ℃水浴條件下恒溫30 min,測量500 nm 波長處吸光度,根據(jù)原花青素標準曲線,計算濃度。

原花青素得率計算公式如下:

式中,V:提取液體積(mL);C:原花青素濃度(mg/mL);n:稀釋倍數(shù);W:婆棗干重(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Box-Benhnken的實驗設計原理,通過SAS軟件對數(shù)據(jù)進行處理與回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 研磨時間對婆棗原花青素得率的影響 由圖1可知,隨著研磨時間的增加,原花青素的得率逐漸增加,在研磨時間為15 min時,原花青素的得率達到最大值1.912%,繼續(xù)增加研磨時間,原花青素的得率呈現(xiàn)下降的趨勢。其原因在于,剛開始研磨,束縛婆棗中原花青素的結(jié)構(gòu)沒有被徹底破壞,能夠在乙醇溶液中溶出的原花青素較少,當束縛結(jié)構(gòu)被完全破壞，得率出現(xiàn)最大值,研磨時間再增加,研磨材料可能破壞原花青素結(jié)構(gòu),所以得率開始減少。綜上所述,用于響應面試驗的最適研磨時間為15 min。

圖1 研磨時間對原花青素得率的影響

2.1.2 研料粒徑(直徑)對婆棗原花青素得率的影響 由圖2可知,隨著研磨材料粒徑的增加,原花青素的得率逐漸增加,在研磨材料粒徑為3 mm時,原花青素的得率達到最大值1.911%,研磨材料粒徑繼續(xù)增大,原花青素的得率呈現(xiàn)下降趨勢。其產(chǎn)生的原因是,粒徑越小研磨面積越大,與婆棗接觸越充分,對其組織結(jié)構(gòu)破壞越完全,使得越多的原花青素析出,得率越高。綜上所述,用于響應面試驗的最適宜研料粒徑為3 mm。

圖2 研料粒徑(直徑)對原花青素得率的影響

2.1.3 研料用量(體積比)對婆棗原花青素得率的影響 由圖3可知,隨著研磨材料用量的增加,原花青素的得率逐漸增加,在研磨材料用量為30%時,原花青素的得率達到最大值1.912%,研磨材料用量繼續(xù)增大,原花青素的得率呈現(xiàn)平穩(wěn)的趨勢。原因在于,研磨材料粒徑一定的情況下,用量越大，研磨面積越大,對于婆棗組織破壞程度越大,原花青素自由運動程度增加得率越大,用量達到一定程度研磨面積達到極值,得率不再顯著增加而是趨于平穩(wěn),研料用量(體積比)確定為30%。綜上所述,用于響應面試驗的最適宜研料用量為30%。

圖3 研料用量(體積比)對原花青素得率的影響

2.1.4 研磨溫度對婆棗原花青素得率的影響 由圖4可知,隨著研磨溫度的增加,原花青素的得率逐漸增加,在研磨溫度為60 ℃時,原花青素的得率達到最大值1.913%,研磨溫度繼續(xù)增大,原花青素的得率呈現(xiàn)下降的趨勢。主要原因在于,研磨溫度升高會使分子運動速度加快,同時滲透、擴散、溶解速度加快,原花青素的提取量會增多;但是研磨溫度過高導致原花青素氧化,結(jié)構(gòu)被破壞，得率降低[17]。綜上所述,用于響應面試驗的最適宜研磨溫度為60 ℃。

圖4 研磨溫度對原花青素得率的影響

2.1.5 液料比對婆棗原花青素得率的影響 由圖5可知,隨著液料比的增加,原花青素的得率逐漸增加,在液料比為25∶1 (mL/g)時,原花青素的得率達到最大值1.913%,液料比繼續(xù)增大,原花青素的得率呈現(xiàn)平穩(wěn)的趨勢。這是因為液料比越大,溶液與原花青素接觸面積越大,原花青素進入溶液量越多,得率越高,液料比增大一定程度,能夠擺脫婆棗組織結(jié)構(gòu)束縛進入溶液的原花青素完全析出,得率達到最大值,液料比再增加沒有實際控制意義[18],液料比確定為25∶1 (mL/g)。綜上所述,用于響應面實驗的最適宜液料比為25∶1 (mL/g)。

圖5 液料比對原花青素得率的影響

2.1.6 乙醇體積分數(shù)對婆棗原花青素得率的影響 由圖6可知,隨著乙醇體積分數(shù)的增加,原花青素的得率逐漸增加,在乙醇體積分數(shù)為60%時,原花青素的得率達到最大值1.912%,乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大,原花青素的得率呈現(xiàn)下降的趨勢。原因是,乙醇體積分數(shù)增加提高了溶液極性，有助于原花青素的析出,得率升高,根據(jù)相似相溶的原理，當乙醇溶液極性和原花青素分子極性一致時得率最大,當乙醇濃度再增大,婆棗中的脂溶性雜質(zhì)將和原花青素將競爭與乙醇作用,影響原花青素分子析出,得率降低。綜上所述,用于響應面實驗的最適宜乙醇體積分數(shù)為60%。

圖6 乙醇體積分數(shù)對原花青素得率的影響

2.2 響應面優(yōu)化提取婆棗皮原花青素工藝

2.2.1 響應面試驗結(jié)果及回歸方程的確定 根據(jù)響應面實驗設計測定得率,結(jié)果如表2所示,利用SAS軟件對實驗結(jié)果進行回歸分析如表3,通過回歸分析建立得率預測模型:

表2 響應面實驗方案及結(jié)果

表3 回歸方程方差分析結(jié)果

2.2.2 響應面交互作用分析 根據(jù)回歸模型,將任兩水平固定在零水平,可以得到另外兩因素交互作用的響應面圖及對應等高線圖,反映了各因素交互作用對提取得率的影響。本研究中各因素交互作用見圖7～圖12。

圖7 研磨粒徑與研磨時間交互作用的響應面圖

圖8 研磨粒徑與乙醇體積分數(shù)交互作用的響應面圖

圖9 研磨粒徑與研磨溫度交互作用的響應面圖

圖10 研磨時間與乙醇體積分數(shù)交互作用的響應面圖

圖11 研磨時間與研磨溫度交互作用的響應面圖

圖12 乙醇體積分數(shù)與研磨溫度交互作用的響應面圖

由圖7～圖12可知,研磨粒徑與研磨時間、研磨粒徑與研磨溫度、研磨時間與乙醇體積分數(shù)、研磨時間與研磨溫度之間的交互作用顯著(p<0.05),表現(xiàn)為圖7、圖9、圖10、圖11的等高線為橢圓形。對比各圖可知,研磨粒徑、研磨時間、乙醇體積分數(shù)、研磨溫度對深州婆棗中原花青素的提取得率影響顯著(p<0.05),表現(xiàn)為圖7～圖12的曲面都較陡。

2.2.4 響應面優(yōu)化工藝實際驗證實驗 對擬合函數(shù)

模型進行求解,計算極大值,結(jié)果為:X1為3.12 mm,X2為16.16 min,X3為61.23%,X4為62.12 ℃,極大值Y為1.941%。根據(jù)響應面多元二次方程求解以及單因素實驗得到最佳工藝為:研料粒徑3 mm,研磨時間16 min,研料用量(體積比)30%,研磨溫度62 ℃,液料比25 mL/g,乙醇體積分數(shù)61%。在最優(yōu)工藝條件下進行3次實際實驗驗證,得率為:1.942%±0.001%,與擬合函數(shù)模型最大計算值相比相差很小,相對誤差為0.052%,擬合函數(shù)模型是可用的。

利用乙醇溶劑浸提[5]、超聲波[2]、蒸制法[3]、機械研磨法分別對大棗中原花青素進行提取,得率分別為1.81%、1.86%、0.9%、1.943%,機械研磨輔助提取法提取大棗中原花青素得率最高。

3 結(jié)論

機械砂磨輔助提取婆棗中原花青素優(yōu)化工藝條件為:研料粒徑3 mm、研磨時間16 min、研料用量(體積比)30%、研磨溫度62 ℃,液料比25 mL/g、乙醇體積分數(shù)61%,在優(yōu)化工藝條件下婆棗中原花青素得率為1.942%±0.001%。實際驗證實驗表明,預測回歸方程模型預測最大得率與驗證試驗得率相對誤差為0.052%,擬合函數(shù)模型是可用的。實驗證明機械砂磨提取婆棗中原花青素是可行的,機械砂磨可以破壞分子間作用力,破除束縛組織中束縛原花青素的結(jié)構(gòu),有效提高原花青素提取率,另外機械砂磨屬于機械性物理外力,不會引起污染,同時機械砂磨效率高、成本低,是實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的可行性途徑。