牛樟芝醇提物體外抗炎活性研究

李木霞,蘇冀彥,李 丹,林 吉,謝意珍2,,李運容

(1.廣州中醫(yī)藥大學,廣東廣州 510006;2.廣東粵微食用菌技術有限公司,廣東廣州 510530;3.廣東省微生物研究所省部共建華南應用微生物重點實驗室,廣東廣州 510070;4.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院,廣西南寧 530021)

牛樟芝(Antrodiacinnamomea,AC)又稱樟芝、牛樟菇、樟菰、樟內菇、紅樟等,是一種獨特而珍貴的臺灣地道藥食兩用真菌,屬于真菌界(Kingdom Fungi)擔子菌門(Basidiomycota)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)的多年生蕈菌類[1-3]。野生牛樟芝生長于臺灣獨有的珍貴樹種牛樟樹的心材內壁或枯死伏地的牛樟樹表面,有“森林中的紅寶石”之稱。牛樟芝醇提物(Antrodiacinnamomeaethanol extract,AC-E)主含萜類,多為三萜,且野生牛樟芝中萜類的含量比培養(yǎng)的牛樟芝中高出10～30倍[4]?，F(xiàn)有研究表明,其三萜類化合物具有抗腫瘤[5-6]、抗病毒[7-8]、抗炎[9-10]和保肝[11-12]等藥理作用,可預防和治療癌癥、肝炎等多種疾病。本實驗建立體外炎癥模型,旨在研究牛樟芝抗炎活性的主要機制,為牛樟芝在新藥的應用開發(fā)奠定實驗基礎。

脾是機體內最大的免疫器官,內含大量的免疫細胞,在體液免疫和細胞免疫的地位極其重要。研究中藥及其有效成分對機體免疫系統(tǒng)的作用是研究中醫(yī)藥免疫調節(jié)作用的一個重要方面[13],淋巴細胞增殖反應是非常重要的免疫指標,其中T淋巴細胞增殖反應是反映T細胞功能和機體細胞免疫的主要指標之一[14]。外源性化學物(如藥物和環(huán)境污染物等)對T淋巴細胞分化、成熟、增殖和信號轉導的影響一直是免疫毒理學研究的難點和熱點。T淋巴細胞(CD3+)接受抗原刺激可分化成不同亞型,其中包括T細胞亞群輔助性T細胞(Helper T cell、Th、CD3+CD4+)與細胞毒性T細胞(Cytotoxic T cell,Tc,CD3+CD8+),機體維持正常免疫功能有賴于各種免疫細胞特別是T細胞亞群之間的相互協(xié)作和制約,進而產生適度的免疫應答,使之既可以清除異物抗原,又可以不損傷正常組織。刀豆蛋白(Concanavalin A,ConA)是從巴西橡膠刀豆(Canavaliabrasiliensis)中提取的植物凝集素,是一種多克隆非特異性T細胞的有絲分裂原,是T淋巴細胞增殖反應常用的刺激劑。

動物預實驗中發(fā)現(xiàn)AC-E有明顯的抗炎作用,但作用機制尚未明確。有研究[15-17]發(fā)現(xiàn),從牛樟芝中分離的馬來酰亞胺衍生物、糖蛋白可以有效降低脂多糖引起的RAW264.7 巨噬細胞免疫應答,顯示牛樟芝具有抗炎作用。研究表明[18],牛樟芝菌絲體中的methyl antcinate K 可以增強樹突細胞活性，促進Th2 細胞分化,增強免疫應答,具有一定的免疫調節(jié)作用。Th細胞通過合成和分泌細胞因子,促進B細胞、T細胞和其它免疫細胞的增殖與分化,協(xié)調免疫細胞間的相互作用;Tc細胞具有細胞毒性,能特異性殺死異常靶細胞。正常情況下,T淋巴細胞群中的Th細胞、Tc細胞的比值維持動態(tài)平衡,它們相互協(xié)作或相互制約,以產生適度的免疫應答,如果其平衡被破壞,發(fā)生免疫紊亂,就會產生一系列病理改變及疾病[19]。本實驗采用ConA刺激脾淋巴細胞增殖模擬機體炎癥狀態(tài),觀察牛樟芝提取物對上述體外模型中T細胞的影響,以探討牛樟芝潛在的抗炎作用。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

雄性BALB/c小鼠(SCXK(粵)2013-0002,SPF級,體重18～22 g) 購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心,飼養(yǎng)于廣東省微生物研究所實驗動物中心(室溫20～24 ℃,相對濕度40%～70%,自由飲水攝食);牛樟芝(采摘后迅速低溫干燥,避光保存) 臺灣;RPMI-1640基礎培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗(10000 units/mL青霉素,10000 μg/mL鏈霉素) Corning公司(美國);胰酶細胞消化液 Hyclone公司(美國);胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS) 依科賽生物(中國);磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS) Gibco公司(美國);牛血清白蛋白(Albumin BovineⅤ,BSA) Solarbio公司(美國);MTS粉末(Cell Titer 96? AQueous MTS Reagent Powder) Promega公司(美國);刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA) Sigma公司(美國);Annexin-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(80090352) 聯(lián)科生物(中國);二甲基亞砜(DMSO,AR) 天津市富宇精細化工有限公司(中國);流式細胞檢測抗體FITC anti-mouse CD3(4320569)、PE-Cyanine 7 anti-mouse CD4(4280800)、APC-CyTM7 anti-mouse CD8(7025872) eBioscience公司(美國);TNF-αELISA試劑盒(AD20180710)、IFN-γELISA試劑盒(AD20180710) Andy gene 公司(美國)。

BSC-1800IIA2型超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司(中國);Gabaxy 170S+型CO2培養(yǎng)箱 Eppendorf公司(德國);Thermo MK3型酶標儀 Thermo公司(美國);IX71型顯微鏡 Olympus公司(日本);IC1000型自動細胞計數(shù)儀 Countstar公司(中國);AUY220型電子天平 島津公司(日本);RE6000A型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(中國);FACSCanToⅡ流式細胞分析儀 Becton Dickinson公司(美國);DFY-500型500 g搖擺式高速中藥粉碎機 浙江大德藥業(yè)集團有限公司(中國);GB6003-85型藥典檢驗篩 浙江上虞市華豐五金儀器有限公司(中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制

1.2.1.1 牛樟芝醇提物(AC-E)的制備 將牛樟芝子實體經除雜、清洗、晾曬至干后,置于烘箱,60 ℃干燥4 h至水分含量8%以下[20]。取烘干后的子實體經搖擺式高速中藥粉碎機中打粉(25000 r/min,每5 s間隔一次,粉碎3次),使用孔徑為4目(65 μm)～50目(355 μm)藥典檢驗篩進行篩選,收集子實體顆粒[21]。稱取上述顆粒20 g,裝入圓底燒瓶,加入86%乙醇200 mL,室溫浸泡4 h后,再加入86%乙醇600 mL,80 ℃加熱回流1.5 h,過濾,收集濾液,濾渣重復上述加熱回流提取操作1次[21],將所得2次濾液合并,減壓濃縮至無醇味,凍干即得。

1.2.1.2 RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制 10%滅活FBS+1%青鏈霉素雙抗+89% RPMI-1640基礎培養(yǎng)基

1.2.1.3 AC-E配制 稱取100 mg AC-E,加DMSO使AC-E的濃度為100 mg/ml,溶解完全后用0.22 μm微孔濾膜濾過;濾液分別用RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制成孔內終濃度為50、25、12.5 μg/mL三個濃度。

1.2.1.4 ConA溶液配制 用RPMI-1640完全培養(yǎng)基將ConA配制成孔內終濃度為3 μg/mL。

1.2.1.5 紅細胞裂解液配制 精確稱取氯化銨(9290 mg)、碳酸氫鉀(1000 mg)、EDTA(37 mg),溶于1 L雙蒸水中,調節(jié)pH為7.21～7.23,過0.22 μm微孔濾膜。

1.2.2 脾細胞制備 小鼠脫臼處死[17],浸泡在75%乙醇中消毒,轉移至超凈臺內,剖取脾臟,用PBS清洗。另在超凈臺內準備好6 cm培養(yǎng)皿,倒入少量PBS,覆蓋一張200目滅菌濾布,將脾臟置于濾布上,稍微剪碎后,用玻璃注射器活塞研磨脾臟至無明顯塊狀。移除濾布,轉移培養(yǎng)皿濾液至離心管,離心(300×g,5 min)去上清;加入1 mL自制ACK裂解液(室溫)重懸細胞,室溫靜置5 min,加入7 mL預冷PBS,離心(300×g,5 min),去上清;再分別用5 mL預冷PBS離心洗滌2次后,用400 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞,進行細胞計數(shù),調節(jié)細胞濃度為3×106個/mL。

1.2.3 AC-E對小鼠脾淋巴細胞活力的影響 取兩塊96孔板,命名為板1、板2,其中板1設正常組、AC-E組(50、25、12.5 μg/mL);板2設正常組、模型組、AC-E組(50、25、12.5 μg/mL)。

板1給藥如下:

正常組:完全培養(yǎng)基+含0.1% DMSO RPMI-1640完全培養(yǎng)基+細胞懸液;

AC-E組:不同濃度AC-E+含0.1% DMSO RPMI-1640完全培養(yǎng)基+細胞懸液。

板2給藥如下:

正常組:RPMI-1640完全培養(yǎng)基+含0.1% DMSO RPMI-1640完全培養(yǎng)基+細胞懸液;

模型組:ConA溶液+含0.1% DMSO RPMI-1640完全培養(yǎng)基+細胞懸液;

AC-E組:ConA溶液+不同濃度AC-E+細胞懸液。

每組設3個復孔,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h在每孔加入MTS液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,于酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處檢測光密度 OD值,作為淋巴細胞增殖的指標,調零孔僅加200 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基。相對細胞活力計算公式如下。

相對細胞活力(%)=(OD藥物組-OD調零孔/OD正常組-OD調零孔)×100

1.2.4 AC-E對小鼠脾淋巴細胞凋亡的影響 分組及給藥與1.2.3板2一致,每組設3個復孔,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h后,在96孔板中將細胞吹打均勻,收集細胞懸液,使用FCM檢測AC-E對小鼠脾淋巴細胞凋亡的影響。分為單陽性對照管和實驗管,分別加入2 mL預冷PBS離心(300×g,5 min)洗滌兩次,棄上清。

單陽性對照管加入500 μL Apoptosis Positive Control Solution重懸,置冰上孵育30 min,用預冷PBS離心(300×g,5 min),洗滌棄上清,加入適量預冷1×Binding Buffer重懸,并加入數(shù)量相同且未經處理的活細胞與之混合,加預冷1×Binding Buffer補充至1.5 mL,等分成三管,其中一管為空白對照管、兩管為單陽性對照管。單陽性對照管分別加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI,室溫避光孵育5 min,即可上機調試。

實驗管分別加入500 μL 1×Binding Buffer重懸細胞,分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI,輕柔渦旋混勻后,室溫避光孵育5 min,即可上機檢測。

細胞凋亡率(%)=凋亡早期細胞比例(%)+凋亡晚期細胞比例(%)

1.2.5 AC-E對小鼠脾淋巴細胞T細胞比例及T細胞亞群的影響 分組及給藥與1.2.3板2一致,每組設3個復孔,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h后,在96孔板中將細胞吹打均勻,收集細胞懸液,使用流式細胞術檢測AC-E對脾淋巴細胞中T細胞、Th細胞、Tc細胞的比例及活化程度。

單陽性對照和空白對照:取5管,分別加入FITC anti-mouse CD3(0.125 μg/test)、PE-Cyanine 7 anti-mouse CD4(0.0625 μg/test),APC-CyTM7 anti-mouse CD8(0.1 μg/test)的0.5% BSA/PBS緩沖液,作為單陽性對照;同時設一個無抗體空白對照,作為陰性對照,輕柔渦旋混勻后,室溫避光孵育30 min。加入600 μL 0.5% BSA/PBS緩沖液洗滌2次。最后用0.5% BSA/PBS緩沖液200 μL重懸細胞,即可上機調試。

樣品:各樣品管,每管加入60 μL含F(xiàn)ITC anti-mouse CD3(0.125 μg/test)、PE-Cyanine 7 anti-mouse CD4(0.0625 μg/test)、APC-CyTM7 anti-mouse CD8(0.1 μg/test)的0.5% BSA/PBS緩沖液;輕柔渦旋混勻后,室溫避光孵育30 min,加入600 μL 0.5% BSA/PBS緩沖液洗滌2次,最后用0.5% BSA/PBS緩沖液200 μL重懸細胞,即可上機檢測。

1.2.6 AC-E對小鼠脾淋巴細胞的細胞因子TNF-α、IFN-γ表達的影響 分組及給藥與1.4板2一致,每組設3個復孔,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h后,在96孔板中將細胞吹打均勻,收集細胞懸液,3000 r/min離心(20 min),收集細胞上清液,操作步驟按照ELISA 檢測試劑盒說明書進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與討論

2.1 AC-E對小鼠脾淋巴細胞活力的影響

由圖1A可知,AC-E對小鼠脾淋巴細胞無明顯細胞毒作用,圖1B中,模型組細胞增殖相對細胞活力(177.40%±8.686%)與正常組相比差異極顯著(p<0.01);AC-E干預72 h后,低劑量組的相對細胞活力(173.80%±4.075%)與模型組相比無顯著變化;中高劑量則極顯著低于模型組(128.90%±8.499%、82.49%±3.528%),說明AC-E對ConA誘導的淋巴細胞增殖有極顯著的抑制作用(p<0.01),AC-E對該炎癥模型同樣具有抗炎作用。

圖1 AC-E對小鼠脾淋巴相對細胞活力的影響

2.2 AC-E對小鼠脾淋巴細胞凋亡的影響

圖2A是FCM檢測正常組、模型組、給藥組對脾淋巴細胞凋亡影響的代表性圖譜,圖2B是給予ConA及AC-E干預,小鼠脾淋巴細胞連續(xù)培養(yǎng)72 h后的凋亡率。

圖2 AC-E對小鼠脾淋巴細胞凋亡的影響

由圖2A得,正常組的細胞幾乎無凋亡現(xiàn)象,而模型組及三個給藥組的細胞均出現(xiàn)了明顯的凋亡。由圖2B可知,小鼠脾淋巴細胞連續(xù)培養(yǎng)72 h后,未經ConA刺激的正常組凋亡不明顯(1.100%±0.100%),加入ConA刺激的模型組(4.533%±0.208%)出現(xiàn)極顯著凋亡(p<0.01),加入ConA刺激后給予AC-E干預,低中高劑量組(6.067%±1.041%、8.800%±0.265%、12.500%±1.249%)的細胞凋亡率極顯著升高(p<0.01)。且較于模型組,中高濃度給藥組的細胞極顯著凋亡(p<0.01)。而ConA特異性刺激T淋巴細胞增殖,給予AC-E干預后細胞出現(xiàn)明顯凋亡,因此可以推測AC-E是否誘導了T細胞凋亡。

2.3 AC-E對小鼠脾淋巴細胞T細胞比例的影響

圖3A是FCM檢測正常組、模型組、給藥組(低、中、高劑量)T細胞比例的代表性圖譜,圖3B是給予ConA及AC-E干預,小鼠脾淋巴細胞連續(xù)培養(yǎng)72 h后T細胞的比例變化。

圖3 AC-E對小鼠脾淋巴細胞T細胞比例的影響

由圖3A得,模型組的T細胞比正常組明顯增加,給藥組的T細胞出現(xiàn)了不同程度的減少。T細胞在許多免疫性疾病的發(fā)病中起重要作用[22-24],它所啟動的免疫可有效保護機體免受感染的侵害或者抑制腫瘤發(fā)生[21,25]。然而,若被激活及過度增殖的T細胞所啟動的免疫反應不受控制,或者原有的免疫平衡被打破,則可誘發(fā)多種嚴重的免疫性疾病。由圖3B可知,ConA刺激的小鼠脾淋巴細胞T細胞雖有增殖(模型組78.170%±1.139%),但給予AC-E干預后,與正常組(70.530%±2.554%)相比,低劑量組(70.100%±1.419%)的T細胞比例無顯著差異,中、高劑量組(60.630%±2.803%、51.670%±2.074%)的T細胞比例分別顯著(p<0.05)、極顯著(p<0.01)降低,說明低劑量的AC-E使受ConA刺激增殖的T細胞控制在正常免疫水平。

2.4 AC-E對小鼠脾淋巴細胞T細胞亞群的影響

圖4A是FCM檢測正常組、模型組、給藥組(低、中、高劑量)的T 細胞亞群比例的代表性圖譜,圖4B是給予ConA及AC-E干預,小鼠脾淋巴細胞連續(xù)培養(yǎng)72 h后T細胞亞群的比例變化。

圖4 AC-E對小鼠脾淋巴細胞T細胞亞群的影響

如圖4A造模及給藥后,Th細胞減少,而Tc細胞明顯增多。圖4B中,小鼠脾淋巴細胞刺激給藥后,低、中、高劑量組(40.410%±1.542%、34.090%±1.799%、33.370%±1.694%)的Th細胞比例極顯著低于正常組(62.980%±2.534%,p<0.01),模型組(51.440%±2.059%)亦有極顯著降低(p<0.01),但圖4C中模型組(21.390%±0.551%)極顯著高于正常組(6.205%±0.872%，p<0.01),圖4D中模型組(2.412%±0.154%)Th細胞和Tc細胞的比例仍然極顯著少于正常組(10.640%±1.793%,p<0.01),說明ConA刺激T細胞增殖后更多地轉化為Tc細胞。而對于Tc細胞來說,低、中、高劑量組(23.740%±0.357%、20.110%±0.480%、13.010%±0.150%)均極顯著高于正常組(6.205±0.872%,p<0.01),低劑量組的Tc細胞比例極顯著高于模型組(p<0.01),可能是因為低劑量的AC-E作為外源物質對脾淋巴細胞也有刺激作用,激活T細胞向Tc細胞轉化,見圖4C。由圖4D中可知,各組Th/Tc細胞的比例均極顯著低于正常組(p<0.01),結合圖3,說明T細胞在ConA刺激及給予AC-E干預,T細胞出現(xiàn)明顯凋亡是由于體系內Th/Tc需維持動態(tài)平衡而出現(xiàn)的Th細胞及Tc細胞凋亡所致。

2.5 AC-E對小鼠脾淋巴細胞的細胞因子TNF-α、IFN-γ表達的影響

圖5A是小鼠脾淋巴細胞TNF-α的表達,圖5B是AC-E對小鼠脾淋巴細胞IFN-γ表達的影響。

圖5 AC-E對小鼠脾淋巴細胞的細胞因子TNF-α、IFN-γ分泌的影響

牛樟芝的抗炎作用與降低人外周血單核細胞中TNF-α、IL-6 及中介物NO、PGE2 水平,抑制巨噬細胞中IL-1β、IL-18 分泌及NLRP3 炎性體,激活MAPK、NF-κB信號通路有關[26-27]。模型組(24.860±2.007 ng/L)的TNF-α濃度與正常組(9.084±0.915 ng/L)相比,極顯著升高(p<0.01),低、中、高劑量組(17.490±0.638、13.240±1.472、8.196±0.289 ng/L)的TNF-α濃度相比于模型組極顯著下降(p<0.01),見圖5A。模型組(55.550±0.089 ng/L)的IFN-γ濃度極顯著高于正常組(45.880±0.957 ng/L,p<0.01),高劑量組(46.580±0.957 ng/L)的IFN-γ濃度與正常組無顯著性差異,相對于模型組顯著下降(p<0.05),見圖5B。說明AC-E的抗炎作用可通過抑制脾淋巴細胞分泌的TNF-α及IFN-γ發(fā)揮作用。

3 結論

本實驗采用ConA刺激小鼠脾淋巴細胞增殖的體外炎癥模型,實驗結果表明,ConA刺激及給予AC-E干預后,AC-E組的小鼠脾淋巴細胞的相對活力及分泌的TNF-α、IFN-γ與正常組相近,說明AC-E對該模型具有抗炎作用,具有良好的免疫調節(jié)活性。