恒化培養(yǎng)條件下糞產(chǎn)堿桿菌凝膠多糖的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究

王澤建,張 琴,王 萍,莊英萍

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

凝膠多糖是一類直鏈β-1,3-葡聚糖,1996年12月經(jīng)過美國(guó)FDA長(zhǎng)期的安全無毒實(shí)驗(yàn)后，被正式批準(zhǔn)為繼黃原膠和結(jié)冷膠之后的第三個(gè)食品添加劑[1]。目前凝膠多糖市場(chǎng)主要被日本等國(guó)外企業(yè)壟斷。1992年凝膠多糖的研發(fā)生產(chǎn)被納入863計(jì)劃,江蘇省率先開展了凝膠多糖的生產(chǎn),隨后國(guó)內(nèi)各大高校開始了凝膠多糖的發(fā)酵生產(chǎn)研究,但得到的產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)量低,性能較差,成本高,難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[2-3]，不具有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。目前,凝膠多糖的國(guó)內(nèi)市場(chǎng)需求量劇增,迫切需要實(shí)現(xiàn)凝膠多糖的產(chǎn)業(yè)化[4]。

凝膠多糖主要由糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)或土壤桿菌(Agrobacteriumspecies)通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)而得。糞產(chǎn)堿桿菌發(fā)酵生產(chǎn)凝膠多糖是好氧發(fā)酵過程,發(fā)酵過程中菌體濃度、碳源種類、氮源種類與濃度控制、磷酸鹽濃度是影響發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵因素;同時(shí)針對(duì)其高粘度的流體特性,反應(yīng)器結(jié)構(gòu)、攪拌槳系統(tǒng)、通氣方式等是生產(chǎn)過程中影響生產(chǎn)放大的主要因素[5-7]。以葡萄糖為碳源的研究顯示,高濃度的葡萄糖對(duì)于凝膠多糖的合成有較強(qiáng)的抑制作用。目前,有關(guān)凝膠多糖分批發(fā)酵工藝優(yōu)化方面的報(bào)道甚多,分別在氮源限制性濃度、不同階段的pH調(diào)控、供氧水平控制、微量促進(jìn)因子添加等角度研究了工藝條件改變對(duì)分批培養(yǎng)過程中產(chǎn)物合成量的影響,對(duì)提升分批培養(yǎng)過程中凝膠多糖的產(chǎn)量有一定作用[8-9]。

然而,分批培養(yǎng)過程發(fā)酵周期長(zhǎng),培養(yǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生大量不利于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的代謝副產(chǎn)物[10],造成生產(chǎn)效率低。深入了解A.faecalis的生長(zhǎng)和合成代謝特性的響應(yīng)關(guān)系,對(duì)于提升凝膠多糖生產(chǎn)效率非常關(guān)鍵[11]。恒化培養(yǎng)通過連續(xù)添加新鮮物料及廢液的排出可以避免營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏及代謝副產(chǎn)物的抑制;而且達(dá)到穩(wěn)態(tài)后,細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率μ與反應(yīng)器的稀釋率D相等,從而可以通過控制操作變量實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)、比產(chǎn)物合成和底物消耗的控制[12]。因此可以通過恒化培養(yǎng)探索該生產(chǎn)菌最大的產(chǎn)物合成速率及生產(chǎn)能力,為工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)模式的選擇提供理論基礎(chǔ)。

本研究通過恒化培養(yǎng)條件下發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)及動(dòng)力學(xué)模型分析,不僅深入了解微生物的生理代謝特性,而且研究了不同生長(zhǎng)狀態(tài)下細(xì)胞的發(fā)酵特性和最佳生產(chǎn)效率,對(duì)凝膠多糖連續(xù)發(fā)酵控制及生產(chǎn)效率的提升具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌種Alcaligenesfaecalis(YF15) 山東福洋生物科技有限公司提供;牛肉膏、胰蛋白胨 英國(guó)OXOID公司;(NH4)2HPO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCO399%,分析純,國(guó)藥集團(tuán);玉米漿、葡萄糖 山東西王生物科技有限公司。

TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī) 上海恒豐儀器儀表;SBA-40E生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;UV-2012PC型紫外可見分光光度計(jì) 美國(guó)UNICO公司;5L發(fā)酵罐 上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司;尾氣過程質(zhì)譜儀 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 斜面培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3,胰蛋白胨5,NaCl 3,玉米漿 1.5 mL (V∶V),瓊脂20,調(diào)pH7.0,121 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖40,(NH4)2HPO43,MgSO4·7H2O 1,KH2PO41.5,CaCO33,玉米漿1 mL(V∶V),微量元素10 mL (V∶V),調(diào)pH7.0,121 ℃滅菌30 min。

分批培養(yǎng)用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖70,(NH4)2HPO41.5,(NH4)2SO41,NaCl 1,MgSO4·7H2O 0.5,KH2PO41,玉米漿1 mL (V∶V),微量元素10 mL (V∶V),121 ℃滅菌30 min。

恒化培養(yǎng)用發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40,(NH4)2HPO41.5,(NH4)2SO41,NaCl 1,MgSO4·7H2O 0.5,KH2PO41,微量元素10 mL (V∶V),121 ℃滅菌30 min。

1.2.2 種子培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的新鮮斜面種子用無菌水洗滌,按8%(V/V)接種量接入搖瓶,32 ℃培養(yǎng)18～20 h。

1.2.3 分批發(fā)酵培養(yǎng) 在5 L發(fā)酵罐中利用分批發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行分批培養(yǎng),裝液量為2 L,接種量為5% (V/V),培養(yǎng)溫度32 ℃,轉(zhuǎn)速600 r/min,通氣量2 L/min,罐壓0.05 MPa。整個(gè)發(fā)酵過程在線檢測(cè)pH、溶氧、利用質(zhì)譜儀檢測(cè)尾氣并計(jì)算相關(guān)呼吸代謝參數(shù),利用Biostar軟件在線采集。

1.2.4 恒化培養(yǎng) 恒化培養(yǎng)裝置 包括進(jìn)料系統(tǒng)、出料系統(tǒng)、以及發(fā)酵罐部分(圖1)。

圖1 罐恒化培養(yǎng)裝置示意圖

進(jìn)料系統(tǒng)通過蠕動(dòng)泵以某一恒定速率將補(bǔ)料桶的培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐,補(bǔ)料桶配有磁力攪拌器保證培養(yǎng)基充分混合。出料系統(tǒng)由蠕動(dòng)泵控制發(fā)酵液體積為2 L。為避免氮源限制的恒化過程中糖濃度過高引起發(fā)酵液粘稠增加,以及過高糖濃度引起原料的浪費(fèi),根據(jù)殘?zhí)菨舛鹊淖兓{(diào)整恒化培養(yǎng)過程中料液糖濃度。培養(yǎng)基、堿液、流出廢液、發(fā)酵液重量等進(jìn)行在線采集。

在分批發(fā)酵培養(yǎng)菌體生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(6.5～8 h)后,啟動(dòng)恒化培養(yǎng),通過控制恒化培養(yǎng)基連續(xù)流加和排出速率,控制不同稀釋率分別在0.05、0.1、0.16、0.21、0.29和0.32 h-1。過程中,測(cè)定流加培養(yǎng)基和堿液的進(jìn)料體積,恒化流出液的體積,維持發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積一致。過程中pH用氫氧化鈉堿液控制在6.5,通過轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)溶氧濃度不低于15%。通過流加培養(yǎng)基中硫酸銨濃度的調(diào)節(jié)控制銨離子濃度處于限制性濃度,即低于60 mg/L。一般認(rèn)為恒化培養(yǎng)經(jīng)過4～5個(gè)洗脫體積之后,菌體的關(guān)鍵在線參數(shù)CER,以及離線參數(shù)菌體濃度和產(chǎn)物濃度參數(shù)指標(biāo)變化波動(dòng)在5%范圍內(nèi)時(shí),即認(rèn)為已經(jīng)達(dá)到恒化培養(yǎng)擬穩(wěn)態(tài)狀態(tài)。恒化培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)后,細(xì)胞比生長(zhǎng)速率μ與稀釋速率D相等。

1.2.5 不同稀釋率對(duì)糞產(chǎn)堿桿菌生理代謝特性的影響 恒化培養(yǎng)過程進(jìn)入穩(wěn)定期(6.5～8 h)時(shí),稀釋速率與菌體的比生長(zhǎng)速率相等,因此通過控制恒化培養(yǎng)過程中的稀釋速率實(shí)現(xiàn)菌體比生長(zhǎng)速率控制。前期發(fā)酵批次培養(yǎng)結(jié)果顯示[12],A.faecalis利用葡萄糖時(shí)最大的比生長(zhǎng)速率高達(dá)0.36 h-1,因此本次恒化實(shí)驗(yàn)控制的比生長(zhǎng)速率分別為0.05、0.1、0.16、0.21、0.29和0.32 h-1進(jìn)行A.faecalis恒化培養(yǎng),過程中每隔半個(gè)洗脫體積對(duì)二氧化碳釋放速率(CER)、菌濃、凝膠多糖含量(P)、菌體的比銨離子消耗速率(qNHz)、葡萄糖含量、尾氣組分等參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。并根據(jù)測(cè)定參數(shù)統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)過程中細(xì)胞的比葡萄糖消耗速率(qGlc)、比丙酮酸合成速率(qPYR)、比產(chǎn)物合成速率(qp)、比二氧化碳釋放速率(coqco2)、比氧消耗速率(qo2)、比葡萄糖消耗速率(qs)等生理代謝參數(shù)。

1.2.6 代謝特性指標(biāo)的測(cè)定

1.2.6.1 菌濃測(cè)定 稱干重法[13]。

1.2.6.2 銨離子濃度測(cè)定 水楊酸鈉-次氯酸鈉比色法[14],統(tǒng)計(jì)得到單位菌體單位時(shí)間的銨離子消耗速率(qNHz)。

1.2.6.3 葡萄糖濃度測(cè)定 利用SBA-40C生物傳感分析儀測(cè)葡萄糖的濃度[15],統(tǒng)計(jì)得到糖耗速率及單位菌體單位時(shí)間的比葡萄糖消耗速率(qs)。

1.2.6.4 凝膠多糖含量測(cè)定 采用堿溶解和酸沉淀的稱重法[13]及苯酚硫酸法[16]測(cè)凝膠多糖含量。

C(%)=(λ550+0.0297)/0.5813/V取×0.05×D

式(1)

式中：λ550:測(cè)得的吸光度;V取:稀釋后樣品測(cè)定時(shí)的取樣量;D:樣液的稀釋倍數(shù)。

根據(jù)恒化實(shí)驗(yàn)穩(wěn)態(tài)時(shí)的多糖的產(chǎn)量和對(duì)應(yīng)的菌體濃度計(jì)算得到單位菌體單位時(shí)間的比產(chǎn)物合成速率(qp)。

1.2.6.5 有機(jī)酸測(cè)定 Agilent 1100 HPLC系統(tǒng),色譜柱:AquaSep公司C8柱。流動(dòng)相:0.05 mol/L磷酸二氫鉀(pH2.5)∶甲醇=95∶5;流速:0.6 mL/min。進(jìn)樣量:20 μL。柱溫:30 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm。

1.2.6.6 發(fā)酵過程尾氣分析與呼吸代謝參數(shù)測(cè)定 采用尾氣過程分析質(zhì)譜儀對(duì)發(fā)酵的進(jìn)氣和尾氣進(jìn)行實(shí)時(shí)在線采集分析,根據(jù)測(cè)定氣體中氮?dú)狻⒍趸己脱鯕獾鹊臐舛扔?jì)算發(fā)酵過程攝氧率(OUR)和二氧化碳生成速率(CER)[12],比氧消耗速率(qo2)和比二氧化碳釋放速率(qco2)分別利用OUR和CER除以菌濃得到。

1.2.7 葡萄糖代謝平衡計(jì)算

1.2.7.1 碳平衡計(jì)算 發(fā)酵過程中通過統(tǒng)計(jì)不同稀釋速率條件下葡萄糖的流加質(zhì)量、廢液中殘留糖的濃度統(tǒng)計(jì)葡萄糖的碳消耗摩爾數(shù)。通過發(fā)酵液中凝膠多糖、二氧化碳釋放量、菌濃和副產(chǎn)物等的測(cè)定計(jì)算生成的總碳摩爾數(shù)。根據(jù)生成的碳摩爾數(shù)與消耗碳摩爾數(shù)的比值得到碳回收率。

1.2.7.2 碳代謝去向分布 利用發(fā)酵液中凝膠多糖生成量、二氧化碳釋放量、菌濃生長(zhǎng)量和副產(chǎn)物合成量等的測(cè)定值,計(jì)算各自碳摩爾數(shù)占消耗碳摩爾數(shù)百分比,得到消耗葡萄糖的碳去向分布。以上四個(gè)主要去向碳元素的總摩爾數(shù)除以消耗掉的葡萄糖碳元素的總摩爾數(shù),得到碳元素代謝去向分布。

1.2.8 恒化培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算 根據(jù)恒化培養(yǎng)過程中的代謝參數(shù)變化,采用Monod、Luedeking-Piret和Herbert-pirt模型研究了不同比生長(zhǎng)速率條件下糞產(chǎn)堿桿菌的生理代謝特性變化,分析了糞產(chǎn)堿桿菌的生長(zhǎng)、多糖合成和底物葡萄糖消耗的動(dòng)力學(xué)變化。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)過程每個(gè)控制水平做三次重復(fù),每個(gè)取樣點(diǎn)數(shù)據(jù)測(cè)定三次,取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。文中動(dòng)力學(xué)統(tǒng)計(jì)模型利用Origin軟件和Matlab軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸統(tǒng)計(jì)與方差分析[12],得到菌體生長(zhǎng)相關(guān)的產(chǎn)物合成系數(shù)、單位菌體產(chǎn)物合成常數(shù)、菌體對(duì)底物糖的最大得率系數(shù)、能量代謝維持系數(shù)、產(chǎn)物對(duì)底物糖的最大得率系數(shù)等動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 以葡萄糖為碳源不同比生長(zhǎng)速率條件下糞產(chǎn)堿桿菌生理代謝特性分析

2.1.1 恒化培養(yǎng)過程穩(wěn)態(tài)狀態(tài)的判斷 恒化培養(yǎng)過程中,通過調(diào)整流加培養(yǎng)基的流加速率控制菌體的穩(wěn)態(tài)比生長(zhǎng)速率分別為0.05、0.10、0.16、0.21、0.29和0.32 h-1進(jìn)行A.faecalis恒化培養(yǎng),關(guān)鍵過程參數(shù)變化見圖2。從圖中參數(shù)的變化可以看出,在分批培養(yǎng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,通過調(diào)控相應(yīng)的稀釋速率啟動(dòng)恒化培養(yǎng),經(jīng)過不少于4個(gè)洗脫體積后,CER、菌濃和凝膠多糖含量等均達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài),從CER、流出液的菌體濃度(比生長(zhǎng)速率為0.16 h-1除外)和凝膠多糖含量變化中可以看出,菌體代謝進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)。隨著比生長(zhǎng)速率從0.05 h-1增加到0.29 h-1,過程二氧化碳的釋放速率逐漸增加,而流出液的菌體濃度(比生長(zhǎng)速率為0.16 h-1除外)和多糖含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。當(dāng)比生長(zhǎng)速率控制在0.32 h-1的情況下,菌體生長(zhǎng)接近臨界稀釋率,菌體濃度明顯降低,多糖合成大幅度下降。

圖2 不同比生長(zhǎng)速率下糞產(chǎn)堿桿菌恒化培養(yǎng)過程中CER(A)、菌濃(B)和凝膠多糖含量(C)隨洗脫體積的變化

2.1.2 不同比生長(zhǎng)速率下菌體的比速率參數(shù)變化分析 菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)與產(chǎn)物的合成速率、底物的消耗速率、產(chǎn)物得率等息息相關(guān)[12]。糞產(chǎn)堿桿菌在不同比生長(zhǎng)速率條件下的生理代謝參數(shù)見表1。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,隨著比生長(zhǎng)速率的增加,菌體的比銨離子消耗速率(qNHz)、比葡萄糖消耗速率(qGlc)、比二氧化碳釋放速率(qco2)和比氧消耗速率(qo2)不斷升高;有機(jī)酸測(cè)定結(jié)果顯示,糖消耗進(jìn)入糖酵解途徑生成丙酮酸的比合成速率隨著比生長(zhǎng)速率的增加而增加,于0.29 h-1的比生長(zhǎng)速率下達(dá)到最高值0.039 g/g/h,是比生長(zhǎng)速率0.05 h-1時(shí)比合成速率的13倍,之后比產(chǎn)物合成速率趨于穩(wěn)定。而比產(chǎn)物合成速率(qp)則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)稀釋率達(dá)到0.21 h-1時(shí),qp達(dá)到最高值0.171 g/g/h。隨著比生長(zhǎng)速率的繼續(xù)增加,qp呈現(xiàn)快速降低的趨勢(shì),即單位菌體多糖合成速率急劇下降。

表1 不同比生長(zhǎng)速率條件下糞產(chǎn)堿桿菌的生理代謝參數(shù)分析

恒化培養(yǎng)過程中,葡萄糖作為碳源和能源被消耗利用后,主要用于菌體生長(zhǎng)、凝膠多糖合成、有機(jī)酸丙酮酸生成以及二氧化碳釋放。碳回收率統(tǒng)計(jì)計(jì)算結(jié)果顯示,不同比生長(zhǎng)速率情況下碳元素的回收率均在100%±5%合理的范圍內(nèi)[12]。圖3是糞產(chǎn)堿桿菌在不同稀釋率條件下恒化培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)的碳消耗去向分布情況。隨著比生長(zhǎng)速率的增加,葡萄糖流向菌體生長(zhǎng)的比例從18%增加到了47%,增加幅度為160%。流向凝膠多糖合成的碳去向分布由45%降低到了12%,降低幅度為73%。這主要是由于在高比生長(zhǎng)速率的條件下更多糖用于菌體的生長(zhǎng)。副產(chǎn)物丙酮酸的糖消耗占比從低比生長(zhǎng)速率的1%上升到比生長(zhǎng)速率為0.29 h-1時(shí)的5%,這可能是因?yàn)樵诟弑壬L(zhǎng)速率(即高稀釋率)條件下,發(fā)酵培養(yǎng)液中氮源和碳源相對(duì)更充足,促進(jìn)了糖酵解途徑的快速代謝,導(dǎo)致菌體自身的快速生長(zhǎng)以及副產(chǎn)物的大量合成。而當(dāng)比生長(zhǎng)速率繼續(xù)增大到0.32 h-1時(shí),由于菌體合成的碳元素流向分布呈降低趨勢(shì),尤其是用于產(chǎn)物合成的糖去向分布顯著降低,葡萄糖轉(zhuǎn)向二氧化碳生成的比例大幅度增加,達(dá)到了41%。

圖3 不同比生長(zhǎng)速率條件下糞產(chǎn)堿桿菌恒化培養(yǎng)過程的碳元素去向分布

2.1.3 不同比生長(zhǎng)速率下菌體的代謝參數(shù)變化 恒化培養(yǎng)控制不同比生長(zhǎng)速率代謝達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)的菌體生理代謝參數(shù)變化如圖4所示。隨著比生長(zhǎng)速率控制水平從0.05 h-1增加到0.29 h-1,對(duì)應(yīng)的恒化培養(yǎng)稀釋速率也隨之增大,但各稀釋速率條件下穩(wěn)態(tài)時(shí)的菌濃變化并不明顯,均在5 g/L上下波動(dòng)(圖4A)。但是,當(dāng)比生長(zhǎng)速率控制在0.32 h-1時(shí),穩(wěn)態(tài)時(shí)的菌濃快速下降至1.8 g/L,表明該稀釋速率已經(jīng)接近恒化培養(yǎng)的臨界稀釋速率Dc,此時(shí)的比生長(zhǎng)速率已接近該培養(yǎng)基環(huán)境條件下的最大值0.36 h-1,菌體主要以生長(zhǎng)狀態(tài)為主。較高的稀釋體積會(huì)造成培養(yǎng)過程中菌體量的大量洗出,使得菌濃明顯下降。

如圖4B所示,隨著比生長(zhǎng)速率控制水平從0.05 h-1增加到0.29 h-1時(shí),單位體積二氧化碳釋放速率(CER)呈不斷上升趨勢(shì),增長(zhǎng)幅度達(dá)到了74%以上。隨著比生長(zhǎng)速率增加到0.32 h-1,單位體積CER迅速降低,但單位菌體的比二氧化碳釋放速率qco2和比氧消耗速率qo2均呈現(xiàn)出快速上升的趨勢(shì)(表1),表明菌體的呼吸代謝活力大大增強(qiáng)。由圖2C可知,隨著比生長(zhǎng)速率控制水平的提升,恒化穩(wěn)定時(shí)多糖產(chǎn)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì),從最大值14 g/L下降到0.6 g/L。然而,凝膠多糖的比產(chǎn)率變化顯示(表1),當(dāng)比生長(zhǎng)速率為0.21 h-1時(shí),凝膠多糖比合成產(chǎn)率達(dá)到最大值0.171 g/g/h。隨著比生長(zhǎng)速率的進(jìn)一步提升,單位菌體凝膠多糖的合成速率呈下降趨勢(shì)。

圖4 糞產(chǎn)堿桿菌不同比生長(zhǎng)速率下菌體生理代謝參數(shù)變化

2.2 恒化培養(yǎng)條件下凝膠多糖發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析

采用動(dòng)力學(xué)模型對(duì)參數(shù)進(jìn)行評(píng)估分析,量化菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成、底物消耗、銨離子限制性因素等在恒化培養(yǎng)過程中的相關(guān)性對(duì)于了解生產(chǎn)過程代謝動(dòng)力學(xué)非常關(guān)鍵[17]。因此,本研究對(duì)上述6個(gè)不同比生長(zhǎng)速率條件下糞產(chǎn)堿桿菌恒化培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)的菌體生長(zhǎng)、多糖合成、底物消耗過程進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析。

2.2.1 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型 單級(jí)連續(xù)操作攪拌槽式反應(yīng)器(CSTR)進(jìn)行細(xì)胞恒化培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)后,細(xì)胞比生長(zhǎng)速率μ與稀釋速率D相等,可以選用Monod方程擬合,如式(2)。

式(2)

式(3)

圖5反映了銨離子限制條件下恒化培養(yǎng)糞產(chǎn)堿桿菌的銨離子濃度(S)與比生長(zhǎng)速率(μ)之間的關(guān)系。由圖7B可知，1/S與1/μ呈現(xiàn)很好的相關(guān)性,決定系數(shù)達(dá)到0.979。由公式2擬合方程計(jì)算得到μmax=0.36 h-1,Ks=2.27 mg/L。恒化培養(yǎng)穩(wěn)態(tài)條件下能達(dá)到的最大稀釋率Dc不會(huì)超過最大的比生長(zhǎng)速率μmax,否則菌體會(huì)被洗出,恒化系統(tǒng)將不能達(dá)到穩(wěn)態(tài)。該模型擬合得到的最大比生長(zhǎng)速率與前期批培養(yǎng)過程中菌體生長(zhǎng)階段計(jì)算得到的最大比生長(zhǎng)速率一致。飽和常數(shù)Ks是比生長(zhǎng)速率μ達(dá)到其最大值一半時(shí)的基質(zhì)濃度,Ks值越小,菌體對(duì)底物的親和力越強(qiáng),達(dá)到μmax的所需底物濃度越低,底物就更容易被利用。由此得到糞產(chǎn)堿桿菌在銨離子限制條件下的菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型為:

圖5 糞產(chǎn)堿桿菌在銨離子限制濃度S與比生長(zhǎng)速率μ的關(guān)系

μ=0.36S/(2.27+S)

式(4)

2.2.2 銨離子限制條件下凝膠多糖比合成動(dòng)力學(xué)模型 通過探究凝膠多糖批次發(fā)酵過程可知,糞產(chǎn)堿桿菌生產(chǎn)凝膠多糖是部分生長(zhǎng)相關(guān)的過程,即菌體生長(zhǎng)期間,多糖合成量少;當(dāng)菌體達(dá)到穩(wěn)定期,多糖開始大量合成。本論文將利用Luedeking-Piret方程對(duì)部分偶聯(lián)型的凝膠多糖生產(chǎn)過程進(jìn)行擬合(式5):

qp=αμ+β

式(5)

式中:α為與菌體生長(zhǎng)相關(guān)的產(chǎn)物合成系數(shù);β為單位菌體產(chǎn)物合成常數(shù)。

利用Origin軟件將6個(gè)不同稀釋速率條件下的比生產(chǎn)速率分階段進(jìn)行曲線擬合(圖6),得到凝膠多糖的合成動(dòng)力學(xué)模型分別為:

圖6 銨離子限制A.faecalis恒化培養(yǎng)比生長(zhǎng)速率μ與比合成速率qp之間的關(guān)系

式(6)

由于菌體生長(zhǎng)和凝膠多糖的合成均會(huì)受到氮源限制,即氮源濃度過低,菌體生長(zhǎng)受到限制;而氮源濃度過高時(shí),凝膠多糖合成會(huì)受到抑制,所以凝膠多糖合成模型需要考慮到氮源濃度對(duì)其的抑制,根據(jù)酶抑制動(dòng)力學(xué)方程模擬氮源限制的凝膠多糖合成動(dòng)力學(xué)方程:

qp=αμ+β(1-S/Sr)

式(7)

式中:S為銨離子濃度,Sr為限制性銨離子濃度。

當(dāng)S?Sr,即氮源處在限制狀態(tài),則qp=αμ+β;

當(dāng)Sr

將式(4)與式(7)結(jié)合,得到銨離子限制的凝膠多糖合成動(dòng)力學(xué)方程為:

qp=0.36αS/(2.27+S)+β×(1-S/Sr)

式(8)

利用Matlab軟件擬合該方程,得到α、β、Sr的值分別為0.17 g/g、0.14 g/g/h、64.93 mg/L。得到銨離子限制的凝膠多糖合成動(dòng)力學(xué)方程(式9)為:

qp=0.0612S/(2.27+S)+0.14×(1-S/64.94)

式(9)

對(duì)式(8)求導(dǎo)并令導(dǎo)函數(shù)為0,得到限制性的銨離子濃度為5.75 mg/L,即當(dāng)銨離子濃度超過該濃度時(shí),凝膠多糖的合成將會(huì)受到嚴(yán)重限制。因此在凝膠多糖合成過程中,進(jìn)行合理的銨離子濃度控制,對(duì)于提升產(chǎn)率和底物糖轉(zhuǎn)化率非常重要。

2.2.3 銨離子限制下的比底物消耗動(dòng)力學(xué)模型 糞產(chǎn)堿桿菌凝膠多糖發(fā)酵過程中葡萄糖消耗主要用于菌體的生長(zhǎng)、多糖的合成和菌體的呼吸代謝維持,因此比底物消耗Herbert-Pirt方程可以表示為(式10)[18]:

式(10)

qs=1.5μ+qp+0.0625

式(11)

將得到的qp(式6)帶入的比底物消耗速率qs方程(式11)得到Herbert-Pirt方程:

式(12)

從得到的比底物消耗速率模型參數(shù)可以看出,菌體對(duì)葡萄糖的得率系數(shù)為0.67 g/g,該得率系數(shù)高于已有的文獻(xiàn)報(bào)道,主要是與本實(shí)驗(yàn)中銨離子的限制有關(guān),銨離子限制促進(jìn)了菌體對(duì)糖的得率。銨離子限制下菌體的維持系數(shù)為0.063 g/g/h,該參數(shù)高于史其峰等[13]報(bào)道的銨限制條件下維持系數(shù)為0.048 g/g/h,而低于Phillips等[19]報(bào)道的限制性氮源條件下的維持系數(shù)為0.072 g/g/h,主要與不同的糞產(chǎn)堿桿菌突變株及培養(yǎng)基環(huán)境條件有關(guān)。該參數(shù)高于已報(bào)道的分批培養(yǎng)過程中菌體的維持系數(shù)0.031 g/g/h,說明在恒化培養(yǎng)高的比產(chǎn)率條件下(表2),需要產(chǎn)生更多的能量及還原力來維持多糖的合成[20]。

2.3 糞產(chǎn)堿桿菌分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵凝膠多糖合成代謝特性比較

凝膠多糖發(fā)酵生產(chǎn)過程中,比產(chǎn)率反映了單位菌體單位時(shí)間產(chǎn)糖的能力,是用于比較分析不同培養(yǎng)模式對(duì)菌體產(chǎn)糖能力的重要依據(jù)。本研究前期分批培養(yǎng)[12]與銨離子限制下不同比生長(zhǎng)速率控制的恒化培養(yǎng)過程得到的產(chǎn)率和比產(chǎn)率對(duì)比見表2,恒化培養(yǎng)過程中的產(chǎn)率和比產(chǎn)率是遠(yuǎn)優(yōu)于分批培養(yǎng)。從產(chǎn)率上,隨著比生長(zhǎng)速率從0.05 h-1增加到0.21 h-1,產(chǎn)率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì),而且均高于分批培養(yǎng)條件下的產(chǎn)物合成速率。當(dāng)比生長(zhǎng)速率為0.21 h-1時(shí)產(chǎn)物合成速率達(dá)到最高，為0.851 g/L/h,與分批培養(yǎng)(0.389 g/L/h)相比提升了118%。隨著比生長(zhǎng)速率的進(jìn)一步提升,產(chǎn)率呈快速下降的趨勢(shì)。當(dāng)比生長(zhǎng)速率控制在0.32 h-1時(shí),產(chǎn)率只有分批培養(yǎng)的一半,且遠(yuǎn)低于0.21 h-1的比生長(zhǎng)速率時(shí)產(chǎn)率。在比產(chǎn)率上,恒化培養(yǎng)模式均比分批培養(yǎng)要高,最佳稀釋速率為0.21 h-1時(shí)其比產(chǎn)率是分批培養(yǎng)的3倍,能夠明顯提升凝膠多糖的生產(chǎn)效率。

表2 分批培養(yǎng)和恒化培養(yǎng)下curdlan的產(chǎn)率和比合成速率的比較

恒化培養(yǎng)過程的比產(chǎn)率隨著比生長(zhǎng)速率的升高,呈現(xiàn)鐘型曲線變化,說明適當(dāng)控制凝膠多糖發(fā)酵過程中菌體的比生長(zhǎng)速率,能夠改善產(chǎn)物的合成速率及比產(chǎn)物合成速率,這與糞產(chǎn)堿桿菌的凝膠多糖發(fā)酵過程屬于部分偶聯(lián)型有關(guān)。在分批培養(yǎng)過程中,菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成存在明顯的分階段特性,在合成階段菌體比生長(zhǎng)速率較低,菌濃較高,高含量多糖的培養(yǎng)液粘度升高會(huì)限制發(fā)酵液中氧的傳遞速率,從而影響了單位菌體的氧消耗速率和比二氧化碳生成速率(表1),造成在合成階段能量和還原力提供的不足[20-21],限制了凝膠多糖的產(chǎn)率和比合成速率。

3 結(jié)論

本研究通過恒化實(shí)驗(yàn),詳細(xì)考察了銨離子限制條件下不同比生長(zhǎng)速率對(duì)糞產(chǎn)堿桿菌(A.faecalis)發(fā)酵生產(chǎn)凝膠多糖的生理代謝特性參數(shù)的影響。

在銨離子限制條件下的菌體比生長(zhǎng)速率與銨離子濃度之間的動(dòng)力學(xué)模型 μ=0.36S/(2.27+S),凝膠多糖比產(chǎn)率與銨離子濃度間的動(dòng)力學(xué)模型qp=0.0612S/(2.27+S)+0.14×(1-S/64.94),以及比底物葡萄糖消耗速率與比產(chǎn)率的動(dòng)力學(xué)模型:qs=1.5μ+qp+0.0625。

建立了通過其生理代謝參數(shù)的比較,獲得了比生長(zhǎng)速率和比產(chǎn)物合成之間的響應(yīng)關(guān)系,在稀釋率0.21 h-1時(shí),A.faecalis的最高產(chǎn)率可達(dá)到0.85 g/L/h,并且最大的比合成速率高達(dá)0.171 g/g/h,該結(jié)果與批次培養(yǎng)過程相比分別可提升了118%和200%。說明在分批培養(yǎng)過程中,通過氮源營(yíng)養(yǎng)控制合理的菌體比生長(zhǎng)速率對(duì)于提升發(fā)酵產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化效率非常重要。

凝膠多糖發(fā)酵過程中,增加比氧消耗速率和二氧化碳釋放速率能夠促進(jìn)凝膠多糖的合成速率和比合成速率,當(dāng)比氧消耗速率達(dá)到0.217 mmol/g/h時(shí),能夠?yàn)榧?xì)胞的合成代謝提供充足的能量和還原力。過高的比氧消耗速率將加重細(xì)胞的氧脅迫[21],促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和維持能消耗,抑制了細(xì)胞的比產(chǎn)物合成速率。在進(jìn)一步的研究中可以分析物質(zhì)傳遞及發(fā)酵培養(yǎng)液中代謝副產(chǎn)物的變化對(duì)多糖合成與釋放產(chǎn)生抑制機(jī)制。